ＩＸ型コラーゲン破壊の診断
ＮＣ４ドメインのＣ末端部分に近い、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮ末端部分の付近の新規な切断部位、及びＮＣ３ドメインに近いＣＯＬ３ドメインにおける新規な結合部位で切断されたタンパク質断片の存在を検出又はモニターする方法。切断によって生じるネオエピトープ及びＩＸ型コラーゲンに固有のＮＣ４ドメインの切断Ｎ末端部分におけるエピトープに対するネオエピトープ抗体。このような方法の実施に有用な診断キット及び抗体も提示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清及び滑液中の、ＩＬ−１が媒介するＩＸ型コラーゲンの切断断片のレベルを決定することにより、関節疾患などの結合組織を冒す障害、とりわけ、変形性関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、腱断裂、骨粗しょう症、骨軟化症、骨折修復、及び動脈硬化を検出又はモニターすることを目的とした方法に関する。より詳細には、本発明は、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮ末端部分の付近、又はより詳細にはＮＣ４ドメインのＣ末端部分の近くにある新規な切断部位、及びＮＣ３ドメインに近いＣＯＬ３ドメインにおける新規な切断部位で切断されたタンパク質断片の存在の検出又はモニタリングに関する。本発明はまた、切断により生じるネオエピトープ及びＩＸ型コラーゲンに固有のＮＣ４ドメインの切断Ｎ末端部分におけるエピトープに対するネオエピトープ抗体を開示するものである。このような方法の実施に有用な診断キット及び抗体も提示される。
【背景技術】
【０００２】
硝子軟骨のＩＸ型コラーゲンには、主要な構成要素としてＩＩ型コラーゲンを有する線維網の、主要ではない構成要素が存在する。ＩＸ型コラーゲン分子は、ポリペプチド鎖α１、α２、及びα３からなるヘテロ三量体である（２）。それは、中断された三重らせんを有する原線維結合コラーゲン（ＦＡＣＩＴ）に属する。それぞれの鎖は、４個の非三重らせんドメインであるＮＣ１、２、３、及び４に囲まれている３個の三重らせん（コラーゲン性）ドメインであるＣＯＬ１、２、及び３を含む（３）（図９も参照されたい）。ドメインの数字はＣ末端から数える。
【０００３】
電子顕微鏡法を用いて、ＩＸ型コラーゲンがＩＩ型コラーゲン原線維の表面を装飾していること、及びＮＣ４ドメインが球形構造を形成し、それが茎状のＣＯＬ３ドメインと共にＩＩ型コラーゲン原線維から突き出していることが示されている（４）。
【０００４】
ＩＸ型コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲン分子及び他のＩＸ型コラーゲン分子の両方への結合を介して、ＩＩ型コラーゲン原線維に共有結合で架橋している（５〜７）。これらの結合は、ペプチド結合を切断しない作用物質による、成熟軟骨からのＩＸ型コラーゲンの抽出を事実上不可能にする。
【０００５】
ＮＣ４ドメインは、多くの分子、例えばヘパリン及び軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）に対する親和性を有することが示されているが（８〜１０）、ＣＯＬドメインはマトリリン−３と相互作用する（１１）。相互作用するＣＯＭＰ、ＭＡＴＮ−３、及びＣＯＬ９における突然変異は、稀な遺伝性の、分布が不均一な疾患である多発性骨端異形成症を有する患者において見られており、骨端の成長及び骨化に影響する（１２）。
【０００６】
驚くべきことに、ＮＣ４断片は現在、軟骨破壊のバイオマーカーであることが示されている。切断は、軟骨の主要な構造的成分であるアグリカンが放出されてから、主要なコラーゲンが分解されるまでに生じる。Ｘ線観察のように破壊プロセスの後期段階の結果であるコラーゲンマーカーとは対照的に、ＮＣ４断片は、「引き返しの限界点」の前の破壊をもたらすプロセスのマーカーである。アグリカン関連マーカーは、分解進行の初期段階において、また組織の通常の適応化の際に放出され、したがって、病理学的プロセスを特別に示すものではない。さらに、アグリカンマーカーは炎症に関連することが多い。
【０００７】
本発明に記載されているように、ＮＣ４の切断の後、ＩＩ型コラーゲンに架橋したままであるＩＸ型コラーゲンの大部分は、さらに切断されてその後の段階において放出される可能性を有している。本明細書における発明で開示されている、放出された断片の新たなＣ末端に対するネオエピトープ抗体は、このような切断を検出することができた。加えて、本発明において開示されているネオエピトープ抗血清を免疫組織化学で用いて、本明細書において報告されている新規な切断が軟骨のどこで（表面−深部、細胞周囲−領域間）生じているかを決定することができた。組織内に最初に残存していた断片の新たに形成されたＮ末端に対する抗体は、その後の段階におけるこのような断片の放出を検出することができた。タイミングについてのさらなる情報は、ｃｏｌ３ドメインにおける切断により生じたネオエピトープを用いて得ることができた。多くの先行する刊行物及び特許出願が、ＩＸ型コラーゲンに特異的に結合するモノクローナル抗体を記載しているが、それらのいずれも、ＮＣ４付近の切断部位に特異的なネオエピトープ抗体については述べていない。
【０００８】
特許出願ＷＯ１９９０００８１９５Ａ１は、ヒトＩＸ型コラーゲン及びそれに由来する断片に免疫学的に結合するモノクローナル抗体の産生において抗原として有用な、ヒトＩＸ型コラーゲンのセグメントに対応するオリゴペプチドを開示している。しかし、この特許出願において述べられているセグメントはＩＸ型コラーゲンの病理学的破壊には関与しておらず、したがって、関節炎との関係においては期待されない。
【０００９】
Ｉｎｓｔ ｏｆ Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＹに譲渡されたＷＯ２００４１１０４７５Ａ１において、発明は、関節炎の症状を有する個体に対する治療及び耐性誘導のための、ＮＣ４ドメインを含む組成物に関するものである。発明者らはまた、抗関節炎活性又は抗炎症活性を有するポリペプチドを結合組織から回収するための方法を記載している。上記の特許出願のように、抗体は、切断されていないＩＸ型コラーゲンに対するものであり、ネオエピトープ抗体ではない。さらに、出願人らは、ＮＣ４を診断のためのマーカーとしては述べていない。
【００１０】
Ｆｉｂｒｏｇｅｎ Ｉｎｃに譲渡された特許出願ＷＯ１９９９０２１０１１Ａ１は、血清中のＩＸ型コラーゲンのレベルを決定することにより自己免疫障害及び結合組織障害を検出又はモニターするための方法を明らかにしている。ＩＸ型コラーゲンに対する抗体を調製する際に、ＮＣ４ドメインのＮ末端部分における配列が選択された。この抗体は、切断されていないＩＸ型コラーゲンに対するものであり、本明細書の発明におけるような、固有の切断ネオエピトープに対するものではない。
【００１１】
先行文献のいずれも、ＮＣ−４ドメインの排他的な放出をもたらす、このドメインにおいて生じる特定の切断部位については記載していない。組織が特定の疾患において完全に破壊されるという事実にも関わらず、切断の特徴は推測又は予測することができない。とりわけ配列の類似性の観点から、ウシ軟骨及びヒト軟骨において分子の切断が異なることも予想されなかった（図１０）。
【００１２】
したがって、特定の切断部位の発見は新規であり、新たな診断発明を開拓するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明者らは、滑液、血清、尿、及びあらゆる体液などのあらゆるヒト試料におけるＩＸ型コラーゲン破壊の分析を容易にする、同定された新規な切断部位に対する方法として、高感度のウェスタンブロット技術及び高感度の阻害ＥＬＩＳＡを開発した。この種のアッセイは、同定された切断が、患者における軟骨の分解及び関節の劣化において出現するかどうか、並びにいつ出現するかを明らかにするために用いることができた。本明細書の発明の特異的なネオエピトープ抗体を用いることで、アッセイを、疾患の進行の診断及び治療に対する疾患の応答のモニタリングに用いることができる。例えば、骨折の治療中のスポーツマンに対して、トレーニングプログラムを再開する最適な時期を決定するためである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
インターロイキン−１誘導性のウシ鼻軟骨の分解を用いて、１６日間にわたり組織における異化事象を研究した。培地を２Ｄ電気泳動（等電点電気泳動法及びＳＤＳ ＰＡＧＥ）によって分画化した。ペプチドマスフィンガープリンティングによる成分の同定により、１２日目及び１６日目に、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮＣ４ドメインなどのタンパク質断片の放出が明らかになった。
【００１５】
ＮＣ４ドメインのＮ末端部分におけるエピトープに対する新規なペプチド抗体は所見を裏付けるものであり、既に９日目に、断片の１つが存在することを示した。
【００１６】
２つの最も豊富な断片の質量分析により、最も小さい断片が、配列内のアルギニン−２５８とイソロイシン−２５９との間で切断されてＣ末端ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ−（配列番号１）及びＮ末端−ＩＴＰＧＡＲＳＰ（配列番号２）（ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−ＩＴＰＧＡＲＳＰ）を生じさせる、ほぼ完全なＮＣ４ドメインを含むことが明らかになった。
【００１７】
大きい方の断片は、ＮＣ４ドメインと、ＮＣ３ドメインに近い、Ｃ末端ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ−（配列番号３）及びＮ末端−ＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号４）（ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ及び−ＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ）を生じさせる、ＣＯＬ３におけるグリシン−４００とスレオニン−４０１との間に位置する切断部位を有するＣＯＬ３ドメインとを含む。複数の（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮ末端配列の存在は、放出された分子が、ＩＬ−１処理の前に、又はその処理によって、元のＮ末端に非常に近い部位で切断されていることを示している。
【００１８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ−１３）がこの期間において活性であり、フィブロモジュリンを切断することが示されている（１）。ＭＭＰ−１３で処理した軟骨移植片は、ＩＬ−１処理で得られるものと同じサイズ及び同じ切断部位を有する（ＩＸ型）コラーゲンα１断片を放出することが示された。示されたデータは、ＭＭＰ−１３を伴うと考えられる潜在的に重要な分解事象、及び最終的なＩＩ型コラーゲンの損失に先行する分解事象を説明するものである。
【００１９】
ヒト軟骨におけるＩＸ型コラーゲンの切断のさらなる研究により、ＮＣ−４ドメインにヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖の特異的な切断部位もあったが、これは驚くべきことにウシコラーゲンのものとは異なる部位に生じたことが明らかになった。ＮＣ−４ドメインにおける、ヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖のＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱＴＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号５）におけるグルタミン−２６３とスレオニン−２６４との間の部位における切断により、Ｃ末端ＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ−（配列番号６）及びＮ末端−ＴＴＤＥＲＧＰＰ）（配列番号７）（−ＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−ＴＴＤＥＲＧＰＰ）が生じる。ＣＯＬ３ドメイン内の部位に相当する大きい方の断片は、ウシ及びヒトの軟骨に由来するもので同じサイズであり、ウシにおけるＳ３９９がヒトＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００ＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号８）においてはＲ３９９に交換されているにもかかわらず、切断は同じ部位、すなわちＧ４００とＴ４０１との間で生じる。ヒトＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００ＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号８）の切断の結果、２つのネオエピトープＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ（配列番号９）及びＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号１０）が生じる。ヒトＮＣ−４及びＣＯＬ３の新たなネオエピトープ末端の全てに対する抗体が、標準的な方法を用いて開発され、切断断片との特異的な反応性を示した。抗体を用いて、エピトープを検出するためのＥＬＩＳＡを開発した。これらのＥＬＩＳＡを用いて、関節疾患などの結合組織を冒す障害、とりわけ、変形性関節炎、並びに関節リウマチ、腱断裂、骨折修復、及び動脈硬化を有する患者から得た滑液におけるエピトープの存在を示した。本発明の特徴は、本発明を限定するものとは解釈されない以下の実施例を参照することにより、より明瞭に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分離した、１６日目の、ＩＬ−１で刺激したウシ鼻軟骨培地から得たタンパク質を示す図である。一次元目である等電点電気泳動は３〜１０のｐＨ範囲にわたるものであり、二次元目は４〜２０％の勾配ゲルを用いた。画像の左側の数字は参照マーカータンパク質の位置を示す。輪で印を付けたスポットは、（ＩＸ型）コラーゲンα１であると同定されたスポットを示す。異なるＩＸ型コラーゲン断片は、本文中において、２８ｋＤａ断片、５０ｋＤａ断片、及び１００ｋＤａ断片であるとみなされている。画像において、分析した特定のスポットの例に５、８、及び１４と印を付けている。これらのスポットのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）の結果を、以下の図１１ａ、ｂ、及びｃに示す。
【図２】ＩＬ−１で刺激した軟骨移植片の、ＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットを示す図である。ＩＬ−１で刺激した軟骨培養物の６日目、９日目、１２日目、及び１６日目の培地を、１Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離した。２８ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び５０ｋＤａの見かけの質量での陽性シグナルが明瞭に視認可能である。
【図３】２８ｋＤａのＮＣ４断片の最もＣ末端のペプチドから得たタンデム質量分析のデータを示す図である。２８ｋＤａの断片をＡｓｐＮでゲル内消化し、ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化−四重極飛行時間型質量分析）を用いてオンラインで逆相ＬＣ（液体クロマトグラフィー、Ｃ１８カラム）で分析した。推定されるペプチド配列はＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）である。ＩＬ−１で刺激した軟骨から得た培地（１６日目）をまず、２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。この注釈付きのスペクトルは、ＢｉｏＬｙｎｘソフトウェア（ペプチド配列決定、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｊｕｐｄａｌｓｖａｇｅｎ １２−１４ Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ Ｓｗｅｄｅｎ）において生じたものであった。ペプチドのデルタ質量は＜０．０１Ｄａであり、ｙイオンの平均誤差は０．０１Ｄａであり、強度の閾値は０．７５％に設定した。
【図４ａ】ＮＣ４抗血清を用いた、ＩＬ−１及びＭＭＰ−１３で処理した軟骨の培地のウェスタンブロットを示す図である。ＩＬ−１（１６日目）又はＭＭＰ−１３で処理したウシ鼻軟骨から放出されたタンパク質を１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離した。クマシーブルーＧ−２５０で染色したゲル上の同等の位置を切り取り、ゲル内消化し、ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析）を用いてオンラインで逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８カラム）で分析した。両方の２８ｋＤａの断片が、同一の最もＣ末端のペプチドＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）を含んでいた（図３参照）。５０ｋＤａの断片は、Ｐ＊がヒドロキシプロリンである、共通の最もＣ末端のペプチドＲＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ（配列番号３）を共有していた（図４ｂ参照）。右側の挿入図は、４０ｋＤａのバンドを示す、同一のブロットの過剰曝露のバージョンである。
【図４ｂ】ウシＩＸ型コラーゲンの５０ｋＤａの断片における最もＣ末端のペプチドのタンデム質量分析を示す図である。５０ｋＤａの断片をトリプシンでゲル内消化し、ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳＭＳを用いてオンラインで逆相クロマトグラフィーで分析すると、最もＣ末端のペプチド（Ｐ＊がヒドロキシプロリン残基であるＲＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ（配列番号３））のタンデム質量分析のデータが見られた。ＭＭＰ−１３消化溶液を１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーＧ−２５０で染色した。この注釈付きのスペクトルは、ＢｉｏＴｏｏｌｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ、Ｐｏｌｙｇｏｎｖａｇｅｎ ７９ Ｔａｂｙ Ｓｗｅｄｅｎ）において生じたものであった。許容誤差は０．２Ｄａであり、ｂイオン及びｙイオンの平均誤差は０．０６Ｄａであり、強度の閾値は１０に設定した。
【図５ａ】ＭＭＰ−１３又はＩＬ−１で処理したヒト軟骨の、ＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットを示す図である。ヒト関節及びウシ鼻軟骨をＭＭＰ−１３で消化し、後者はＩＬ−１での刺激も行った（１６日目）。消化溶液及び培地を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分離した。
【図５ｂ】ヒトＮＣ４断片の最もＣ末端のペプチドのタンデム質量分析のデータを示す図である。断片をＡｓｐ−Ｎでゲル内消化し、ＬＣ−Ｑｔｏｆ ＭＳで分析した。ロイシン及びイソロイシンは正確な同一の質量を有しており、したがって、スペクトルにおけるＬはＬ又はＩに相当する。推定されるペプチド配列はＥＴＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１１）である。ＭＭＰ−１３で消化した軟骨の培地を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分画化し、その後、質量分析を行った。
【図６】ＭＭＰ−１３で消化したヒト関節軟骨の培地の、ネオエピトープ抗血清を用いたウェスタンブロットを示す図である。ヒト関節軟骨をＭＭＰ−１３で消化した。消化溶液を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分離し、電気泳動でニトロセルロース膜に移し、それを、全ての変異体を認識するＮＣ４における内部エピトープに対するウサギ抗血清（右パネル）、及び左パネルの、ＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３に対するネオエピトープ抗体とインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体で検出した。切断部位全体にわたる連続的な配列を含む大きい方の断片とのネオエピトープの反応性がないことは、切断断片に対する特異性を示している。
【図７】非トリプシン性のＮ末端切断を示す、ＮＣ４ドメインにおけるペプチドＳＮＳＤＧＥＮＥＬＣＰＫ（配列番号１２）のタンデム質量分析データ（ＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴｏｆ ＭＳ）を示す図である。バンドをゲルから切り取り、トリプシンで消化し、その後、オンラインでＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳを用いた逆相クロマトグラフィーを行った。ペプチドを脱アミド化して、このペプチド配列におけるＤ（アスパラギン酸塩）がウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９）においてはＮ（アスパラギン）となるようにする。この注釈付きのスペクトルは、ＢｉｏＬｙｎｘ（ペプチド配列決定、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｊｕｐｄａｌｓｖａｇｅｎ １２−１４ Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ Ｓｗｅｄｅｎ）において生じたものである。ペプチドのデルタ質量は０．０１Ｄａであり、ｙイオンの平均誤差は＜０．０２Ｄａであり、強度の閾値は２％に設定した。同一の実験のデータを図１２ｃに示す。
【図８】図８Ａは、ＳＤＳの存在下及び不在下でＲＡ試料及びＯＡ試料を比較する、ネオエピトープ抗血清を用いる免疫アッセイを示すグラフである。１つのＲＡ患者及び１つのＯＡ患者から得た滑液を、ＳＤＳの存在下又は不在下で分析した。試料は、１：１０、１：４０、及び１：１６０に希釈した。図８Ｂは、４〜１６％ゲル上でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、その後、電気泳動でニトロセルロース膜に移し、ＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１３）切断ネオエピトープに対する抗体を用いて染色した、関節疾患を有する患者から得た滑液試料のウェスタンブロットを示すグラフである。結合したＩｇＧを、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出した。ネオエピトープを含む、選択滑液における２０ｋＤａの断片の存在に注目されたい。この断片は、ＭＭＰ−１３消化の際に関節軟骨から放出された断片よりも多少小さいものである。
【図９】示した切断部位を有するＩＸ型コラーゲン分子の概略図である。細い線は非コラーゲンドメイン（ＮＣ）に相当し、太い線はコラーゲンドメイン（ＣＯＬ）に相当する。矢印は、同定され記載されている切断部位の位置を示している。
【図１０】それぞれ、ヒト及びウシの軟骨におけるＩＸ型コラーゲンの切断配列を示す図である。
【図１１ａ】図１の２Ｄゲルから得たスポット５の、ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示す表である。Ｍａｓｃｏｔペプチドマスフィンガープリントソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたデータベース検索の結果、（ＩＸ型）コラーゲンα１が同定された。ＮＣ４ドメインから得たペプチドのみがスペクトルにおけるピークに適合した。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。Ｍ（ｅｘｐｔ）は、ペプチドの測定されたモノアイソトピック質量であり、Ｈは水素であり、「デルタ」は、適合ペプチドの、測定された質量と理論的に計算された質量との間の差を意味する。「ミス」は、適合ペプチド配列内にどれだけ多くのミスした切断が存在するかを示す。「配列」は、Ｎ末端及びＣ末端の両方にハイフンで分離された１つの余分なアミノ酸を有する適合ペプチドの配列を示す。「修飾」は、質量分析で得られたＭ（ｅｘｐｔ）にペプチド配列を適合させるために必要な、ペプチド配列における修飾を説明するものである。認められた修飾（変動的）は、メチオニンの酸化、及びヒドロキシプロリンを形成するためのプロリン残基のヒドロキシル化であった。システイン残基はリストされなかったため、全てのシステイン残基はカルバミドメチル化されたと考えられた。
【図１１ｂ】図１の２Ｄゲルから得たスポット８の、ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示す表である。その後、Ｍａｓｃｏｔペプチドマスフィンガープリントソフトウェアを用いてデータベース検索を行った結果、（ＩＸ型）コラーゲンα１が同定された。ＮＣ４ドメイン及びＣＯＬ３ドメインの両方におけるペプチドがスペクトルにおけるピークに適合した。ＭＭＰ−１３処理した軟骨移植片から放出された５０ｋＤａの断片を分析した後（図４）、このスペクトルを、切断部位のペプチドに適合するピークの存在について調べた。それはこれらのＭＡＬＤＩデータにおいても存在した（観察された質量＝１２７４．６２８）。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。表の説明については図１１ａにおける記載を参照されたい。
【図１１ｃ】図１の２Ｄゲルから得たスポット１４の、ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示す表である。その後、Ｍａｓｃｏｔペプチドマスフィンガープリントソフトウェアを用いてデータベース検索を行った結果、（ＩＸ型）コラーゲンα１が同定された。ＮＣ４ドメイン、ＣＯＬ３ドメイン、及びＣＯＬ２ドメインから得たペプチドがスペクトルにおけるピークに適合した。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。表の説明については図１１ａにおける記載を参照されたい。
【図１２ａ】Ｍａｓｃｏｔ「ＭＳＭＳ ｌｏｎｓ ｓｅａｒｃｈ」（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたデータベース検索に従った、ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１に適合するペプチドを示す表である。２８ｋＤａの断片を２Ｄゲルから切り出し、ＡｓｐＮでゲル内消化し、ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳ／ＭＳと共にオンラインで逆相ナノＬＣを用いて分析した。これは、図３に示したものと同一の実験から得られたデータである。「Ｍ（ｅｘｐｔ）」は、適合ペプチドのモノアイソトピック質量を意味し、そうでなければ、この表記は図１１におけるものと同一である。イオンスコアは、観察された適合がランダムヒットである可能性に基づくものである（４１）。値が大きいほど良好なヒットであることを示す。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。
【図１２ｂ】２８ｋＤａのウシ断片のＡｓｐＮ消化物において、推定される、トリプシンにより生じる部位が不在であることを示す表である。図３及び図１２ａと同一の実験であるが、推定される「トリプシン性」ペプチドに適合するＡｓｐＮ消化物においてペプチドについて検索したところ、切断部位のペプチドが明らかになった。トリプシン消化に典型的な他のペプチドは同定されなかった。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。
【図１２ｃ】２８ｋＤａのバンドにおける、ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１に適合するペプチドを示す表である。２８ｋＤａのバンドを２Ｄゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化し、Ｑｔｏｆセットアップを用いて分析し、データを用いてＭａｓｃｏｔ「ＭＳＭＳ Ｉｏｎｓ ｓｅａｒｃｈ」でＮＣＢＩ ｎｒデータベースの検索を行った。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする（図７）。「修飾」は、質量分析で得られたｍ／ｚにペプチド配列を適合させるために必要な、ペプチド配列における修飾を説明するものである。認められた修飾（変動的）は、メチオニンの酸化、脱アミド化（アスパラギン及びグルタミン）、並びにヒドロキシプロリンであった。システイン残基はリストされなかったため、全てのシステイン残基はカルバミドメチル化されたと考えられた。
【図１３】ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１鎖に適合するペプチドを示す表である。５０ｋＤａの、ＭＭＰ−１３により生じた試料を１Ｄゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化し、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳセットアップを用いて分析した。データを、Ｍａｓｃｏｔ「ＭＳＭＳ Ｉｏｎｓ ｓｅａｒｃｈ」を用いるデータベース検索によりさらに分析した。これは、図４ｂと同一の実験から得られたデータであった。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。表の説明については図１２ａ及び１２ｃを参照されたい。
【図１４】３０ｋＤａの断片における（ＩＸ型）コラーゲンα１に適合するヒトペプチドを示す表である。１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離したＭＭＰ−１３消化培地から得た、Ａｓｐ−Ｎ消化した３０ｋＤａのバンドのＩｏｎＴｒａｐ分析から得られたデータベース検索の結果である。
【図１５】「含有質量リスト」を示す表である。（ＩＸ型）ヒトコラーゲンα１のＮＣ４のアミノ酸配列に由来する５つのペプチド質量を、逆相ＬＣ ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳセットアップによるＭＳＭＳ分析のために選択した。最初の２つは、ＭＭＰ−１３消化培地の３０ｋＤａのバンドのＡｓｐ−Ｎ消化物において見られた、２つの最もＣ末端のペプチドである。３つ目及び４つ目は、平行して実施した逆相ＬＣ ＥＳＩ．ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによって容易に検出され、対照として含まれた。最後の５つ目は、切断部位がウシにおけるものと同一である場合に予想されるＣ末端ペプチドに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
まずウシでの研究について考察し、さらに、ヒトにおいて本発明の詳細について記載する。
【００２２】
ウシ鼻軟骨のインターロイキン−１誘導性の分解により、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮＣ４ドメインなどの断片の放出が明らかになった。ＮＣ４ドメインのＮ末端部分におけるエピトープに対する本発明の新規なペプチド抗体により、その所見が裏付けられた。
【００２３】
２つの最も豊富な断片の質量分析により、最も小さい断片が、配列ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）（−ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８−ＣＯＯＨ）及び−ＩＴＰＧＡＲＳＰ（配列番号２）（ＮＨ２−ＩＴＰＧＡＲＳＰ）においてアルギニン−２５８とイソロイシン−２５９との間の新規な部位で切断される、ほぼ完全なＮＣ４ドメインを含むことが明らかになった。大きい方の断片は、ＮＣ４ドメインと、ＮＣ３ドメインに近い、ＣＯＬ３におけるグリシン−４００とスレオニン−４０１との間に位置する新規な切断部位、ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ−（配列番号３）（ＲＧＰＰ（ＯＨ）ＧＰ（ＯＨ）ＰＧＰＰ（ＯＨ）ＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ）及びＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号４）（ＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ−）を有するＣＯＬ３ドメインとを含んでいた。
【００２４】
ウシでの研究の結果
ウシのアミノ酸配列
この研究における質量分析に適合したウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１のアミノ酸配列は、「国立生物工学情報センター」（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の非冗長（ｎｒ）データベースにおいて、ｇｉ｜１１９９０１０５９（２２−Ｄｅｃ−０６）という名前で見ることができる。ヒト（ＩＸ型）α１配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ２０８４９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／）との、ＮＣＢＩから得たこの配列のアラインメントにより、Ｎ末端及びＣ末端の主な相違が明らかになる（付録１）。ウシ配列のＮ末端部分はヒト配列よりも３３２アミノ酸長い。この研究において、全ての質量分析データはこの「付加的な」配列のいずれの部分にも適合しなかった。ウシの配列は、ヒトの対応物の最初の６４２個のアミノ酸に対して９０％の類似性を示すが、Ｃ末端における２７９個のアミノ酸は存在しない。このウシ配列は、置換されるべきアーチファクトであると考えられる。したがって、本発明者らは、本明細書においてはヒトの配列を参照して数字の注釈を付けることを選択した。データベース検索の結果は、それらのウシ配列での数字を維持している。
【００２５】
ウシ鼻軟骨移植片の培養
ＩＬ−１で刺激した軟骨移植片から得た培地に放出されたタンパク質（３、６、９、１２、及び１６日）を、２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分離し、ペプチドマスフィンガープリンティングを介して同定した。３日目及び６日目に得たゲルは、とりわけ最上部で不規則な分離を示し、これは、ゲル内に入るには大きすぎる、インタクトな断片化されたアグリカンを大量に含む試料に典型的である。このプロジェクトにおいて、アグリカンが放出された後、しかし主要なコラーゲン放出の前に生じる、その後の分解が焦点であった（４２）。（ＩＸ型）コラーゲンα１は、１２日目及び１６日目から得た培地の２Ｄゲル上では、異なる位置で同定された（典型的なゲルを図１に示す）。ＩＬ−１の不在下でインキュベートした対照試料においては、同じスポットは存在していなかった（データは図示していない）。速く移動したタンパク質スポットの組は２８ｋＤａの見かけの質量を有しており、ペプチドマスフィンガープリンティングにより見られる配列包括度（１３個のピークがペプチドに適合、図１１ａ）により、それらが（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ドメインの主要な部分に相当することが示された。約５０ｋＤａの見かけの質量で移動する（ＩＸ型）コラーゲンα１断片のペプチドマスフィガープリンティングにより、ペプチドに適合した２３個のピークが明らかになり（図１１ｂ）、そのうちの１０個はＣＯＬ３ドメインに由来するものであり、残りはＮＣ４に由来するものであった。（ＩＸ型）コラーゲンα１と同定された、最も遅く移動するスポット（１００ｋＤａの見かけの質量）のペプチド包括度は、ＮＣ４及びＣＯＬ３に加えて、ＣＯＬ２ドメインの一部を含んでいた（２５個のピークがペプチドに適合、図１１ｃ）。これは架橋部分又は全サイズの（ＩＸ型）コラーゲンα１に相当するものであり得、さらなる研究は行わなかった（未知のウシＣ末端配列）。
【００２６】
ペプチド抗体
同定された（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の研究を裏付けるため、またその研究をさらに可能にするために、（ＩＸ型）α１のＮＣ４ドメインのＮ末端部分から得たペプチド（ＮＨ２−ＣＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱ６４−ＣＯＮＨ２）（配列番号１４）を、添加した、キーリンペットヘモシアニンに結合したシステインを用いて合成し、ウサギを免疫化するために用いた。このＮＣ４抗血清は、固相ＥＬＩＳＡにおいてＮＣ４ペプチドへの結合を示した（力価１：５００００）。結合はＮＣ４ペプチドを添加することにより阻害された。０．３ｎｇ／ｍｌのペプチド濃度は、結合の効率的な阻害を示した。
【００２７】
ウェスタンブロット
ポリクローナルＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットにより、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離された、ＩＬ−１で刺激した軟骨培養物から得た培地において、２８ｋＤａ及び５０ｋＤａで（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の存在が裏付けられた。４０ｋＤａに対応する位置にさらなるバンドがあることにより、他の２つよりも多少早く最初に放出された別の（ＩＸ型）コラーゲンα１要素の存在が示された（図２）。これらの３つの断片は、それぞれ２８ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び５０ｋＤａの断片であるとみなされる。
【００２８】
切断部位の同定
ＩＬ−１で刺激したウシ鼻軟骨から得た培地内に放出された（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の存在を受けて、本発明者らは切断部位を探求した。２８ｋＤａの断片を含む２Ｄゲルの切片をトリプシン又はＡｓｐＮで処理し、その後、ＬＣ ＭＳＭＳ（Ｑｔｏｆ）を行った。ＮＣＢＩ非冗長（ｎｒ）、カルバミドメチル（Ｃ）、変動的な酸化（Ｍ）、及び変動的なヒドロキシル化（Ｐ、Ｋ）を用いたＭａｓｃｏｔデータベース検索（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ、ＵＳＡ）では、ＮＣ４ドメインからのペプチドが同定されただけであった。トリプシン消化した試料及びＡｓｐＮ消化した試料の両方において見られた最もＣ末端のペプチドはＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）であった（図３）。これは、トリプシンにより両端で正確に切断されたペプチド、及びＡｓｐＮによりＮ末端は正確に切断されているがＣ末端の切断はプロセシングの前に別の酵素により媒介されなくてはならないペプチドに相当する。図２ａ及び２ｂにおいて、ＡｓｐＮ消化された試料から得たＭＳＭＳデータに適合するペプチドを表にする。トリプシンの特異性を用いた、ＡｓｐＮ消化物におけるペプチドについてのＭａｓｃｏｔ ＭＳＭＳ Ｉｏｎ ｓｅａｒｃｈは、「切断」ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）ペプチドのみを示し、このことは、同定された断片に対してトリプシンの攻撃がなかったことを示していた。２８ｋＤａのスポットのトリプシン消化物は、他のＮＣ４ペプチドに加えて、アミノ酸Ｐｈｅ３１−Ｌｙｓ４６、Ｖａｌ３３−Ｌｙｓ４６、及びＳｅｒ３５−Ｌｙｓ４６をそれぞれカバーする３つのＮ末端ペプチドを含んでいた（図１２ｃ及び図７）。後者の２つは共にＮ末端に非トリプシン切断を有しており、このことは、２つの新たなＮ末端が存在していることを示している。異なるＮ末端の存在は、コラゲナーゼ消化後に単離されたＮＣ４においてこれまでに報告されているが（４３、４４）、本発明者らは自らの一連のデータにおいてこれらの切断を全く観察しなかった。
【００２９】
５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片をトリプシンでゲル内消化し、逆相ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによって分析した。９個のペプチドを配列決定し、それらは、最もＣ末端のペプチド（ＲＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ４００）（配列番号３）が、用いたトリプシンによっては生じないＣ末端切断を有している（Ｐ＊はヒドロキシプロリン残基を示す。データは図示していない）、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４−ＣＯＬ３ドメインに適合した。
【００３０】
主要ではない４０ｋＤａの断片を、ＮＣ４ドメインのみに配列切断を有する（ＩＸ型）コラーゲンα１として同定した。それについてはさらなる研究は行わなかった。
【００３１】
ウシ鼻軟骨のＭＭＰ−１３消化
ＭＭＰ−１３を用いてウシ鼻軟骨を２４時間消化すると、ＩＬ−１でのインキュベーションと同様、軟骨に視覚的影響があり、組織が透明になり始めた。ＮＣ４抗血清を用いた培地のウェスタンブロットにより、ＮＣ４ドメインを含む２つの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片が存在することが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、抗ＮＣ４ペプチド抗血清を用いたウェスタンブロットにより示されるように、それらは一様に２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの断片に移動した（図４ａ）。長時間曝露すると、ＩＬ−１処理した軟骨から得た培地において見られるものに類似した、弱い４０ｋＤａのバンドも出現した（図４ａ、挿入図）。クマシー染色したゲルから得た２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの２つのバンドを有するゲル切片を、それぞれＡｓｐＮ及びトリプシンで消化した。逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによる分析により、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮ末端断片を同定した。２８ｋＤａの断片において見られた最もＣ末端のペプチドはＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）であり、これは、１２日目及び１６日目の、ＩＬ−１で刺激したウシ軟骨培地試料におけるものと同じペプチドである（図３）。ＭＭＰ−１３により生じた５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片について（逆相ＬＣ ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳにより）同定されたペプチドを図１３にリストする。最もＣ末端のペプチドは、トリプシンによっては生じないＣ末端切断を有しており（図４ｂ）、このことは、新たに同定された切断部位を示している。同一のペプチドが、別のＣＯＬ３ドメインペプチドに加え、ＩＬ−１処理した軟骨の試料において検出された（データは図示していない）（同一のｍ／ｚ、荷電状態、及び保持時間がＭＭＰ−１３試料において見られたが、ＭＳＭＳは実施しなかった）。
【００３２】
考察
軟骨の分解がＩＬ−１の刺激により誘発される、関節疾患における組織破壊のこのモデルは、組織高分子の断片化及び放出の研究において頻繁に使用されている。アグリカン断片が最初に放出され、その後にＣＯＭＰ、フィブロモジュリン、そして最後にコラーゲンが放出されることが示されている（４５〜４７）。ＩＬ−１の存在下において培養した軟骨から得た培地において、本発明者らは、２Ｄゲル電気泳動を用い、その後ＭＡＬＤＩ ＭＳを行うことによって、（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の放出を見出した。２８ｋＤａの見かけのＭＷを有する、２Ｄゲル上で検出された最も豊富な断片は、球形のＮＣ４ドメインの大部分に相当するものであった。等電点の大きなインターバルにわたる２Ｄゲル上の２８ｋＤａの断片のスポットの移動は、アスパラギン残基の脱アミド化による可能性がある（４８）。実際、配列決定されたペプチドの１つは脱アミド化を示すと考えられた（図７）。この現象についてのさらなる調査は行わなかった。大きい方の５０ｋＤａの断片は、ＮＣ４、及びＣＯＬ３ドメインの大部分を含むことが示された。
【００３３】
ＩＸ型コラーゲンのドメインＣＯＬ１、ＣＯＬ２、ＮＣ１、及びＮＣ２がＩＩ型コラーゲン原線維と強く結合している一方で、ＣＯＬ３及び球形のＮＣ４は線維表面から突き出している（４９）。ＩＸ型コラーゲンのこの部分は、ＩＩ型原線維と他の細胞外構造要素との間のコネクターとしての役割を果たし得る。裏付けとして、ＩＸ型コラーゲンが不在であると、軟骨は、病原性抗体による自己免疫攻撃に対してより脆弱になり得（５０）、マトリリン−３を保持するその能力が低下する（５１）ことが最近示された。したがって、ＩＸ型コラーゲンの断片化及び組織からの機能的ＮＣ４ドメインの喪失は、軟骨の解体のプロセスにおける重要な初期の段階を反映するものである。
【００３４】
上述した、（ＩＸ型）コラーゲンα１ペプチド抗体は、ＮＣ４ドメインのＮ末端に近い配列に相当する合成ペプチド（Ｃ）ＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱ６４（配列番号１４）に対するものであった。このペプチドを、ＮＣ４ドメインに対する抗体に対する免疫原として以前に用いたペプチドのＣ末端となるように選択したが（５２）、それは、これらの筆者が、彼らが用いた免疫原配列内にいくつかが位置している、複数のＮ末端の存在を記載していたからである。それらの抗体は、とりわけ成長プレートにおけるＩＸ型コラーゲンの変化を記載するために用いられている（５３〜５６）。本発明者らの質量分析データもまた、ＮＣ４ドメインのＮ末端での複数の切断の存在を示したが（１２ｃ及び図７）、そのいずれも、これまでに記載されているものに対応しない。これらの切断がＩＬ−１による刺激の結果であるか、又はこれらが刺激の前に組織内に既に存在しているかは分かっていない。
【００３５】
本発明者らによる新規なＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットにより、９日目、１２日目、及び１６日目の培地において３つの異なるＩＸ型コラーゲン断片が存在することが明らかに示された（図２）。そのうちの２つの見かけの質量は、約２８ｋＤａ及び５０ｋＤａに対応する、２Ｄゲルから以前に同定されたスポットに適合する。４０ｋＤａの見かけの質量を有する３つ目の断片は、９日目の培地において既に見られた。１２日目のＩＬ−１で刺激した軟骨から得た培地において見られた４０ｋＤａの断片をトリプシン消化及び質量分析すると、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ドメインが同定された。見かけの質量は、ＮＣ４ドメインよりも大きな断片を示唆しているが、質量分析のデータは限定された包括度を示し、ＣＯＬ３ドメインのペプチドを全く含まなかった。最も豊富な２８ｋＤａの断片を選択して、さらに広範囲な特徴付けを行った。大きい方の断片は、コラーゲンドメインと、プロリン残基のヒドロキシル化におけるそれらの不均一性と、トリプシンなどの酵素によるプロリンのＮ末端の切断の困難性とから、研究するにはより複雑であると予想された。
【００３６】
エレクトロスプレー質量分析（ＬＣＭＳＭＳ）を用いたオンラインの逆相液体クロマトグラフィーと組み合わせた、トリプシン及びエンドプロテアーゼＡｓｐＮでの消化により、ＣＯＬ３ドメインに対する少数のアミノ酸からなるＮ末端である、ＮＣ４のＣ末端部分における新たな切断が明らかになった。トリプシンを用いて見出された最もＣ末端の断片はＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）であった（ｌ）。Ｃ末端に加えて、ペプチドをカバーする部分を探求するために、ＮＣ４を含む断片をＡｓｐＮで切断した。この酵素はＰＡＲ２５８とそれに続くイソロイシンとの間の切断を生じさせないにもかかわらず、ＡｓｐＮは、トリプシンと同一の、最もＣ末端のペプチドＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８を生じさせた（図３）。ＡｓｐＮ消化物は、トリプシンによる汚染を除き、トリプシンにより生じ得るいかなる他のペプチドも含んでいなかった。別の対照として、長い方の５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片のＡｓｐＮ消化は、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳで検出可能なＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）ペプチドを生じさせず、一方、トリプシンは、アルギニン残基で実際に切断してこの断片を生じさせた（データは図示していない）。５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片をトリプシン消化し、その後、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐＭＳで分析すると、１６日目のＩＬ−１から得た培地においてＣＯＬ３ドメインにおける２つのペプチドが同定された。それらのうち最もＣ末端のものは、Ｃ末端の非トリプシン切断（−ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ（配列番号３）、ＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ−）（配列番号４）を有しており、このことは、この切断が組織においてＩＬ−１での刺激の間に生じたことを示している（図１３及び図４ｂ）。２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの断片は組織から同時に放出され（図２）、したがって、前述の４０ｋＤａの断片の形成と並行して切断されると考えられる。
【００３７】
先の実験において（５７）、軟骨をＩＬ−１で処理すると、ＭＭＰ−１３が活性な形態で現れ、９日目頃からフィブロモジュリンを切断することが示された。フィブロモジュリンにおける切断部位（−ＰＡＹ６３とＡ６４ＹＧ−との間）はＩＸ型コラーゲンにおいて見られた切断部位（−ＰＡＲ２５８ Ｉ２５９ＴＰ−）とは異なるが、本発明者らは、ＭＭＰ−１３での軟骨の消化により、ＩＬ−１で刺激した軟骨移植片の培地において本発明者らが見出した（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４の切断が生じ得るかどうかを試験することとした。
【００３８】
ウシ鼻軟骨移植片をＭＭＰ−１３で消化したところ、実際にこの酵素は（ＩＸ型）コラーゲンα１を切断した。ＮＣ４抗血清を用いるウェスタンブロットにより示される、培地における断片を含むＮＣ４の出現は、ＩＬ−１で誘導した切断により得られたものと非常に類似していた（図４ａ）。ＩＬ−１による刺激で以前に観察された、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４から得られた２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの２つの断片が、ＭＭＰ−１３消化でウシ軟骨から培地内に放出された。９日目、１２日目、及び１６日目にＩＬ−１処理した軟骨において見られた４０ｋＤａのバンドは、このブロットにおいては、より長い曝露時間にすると弱いバンドとして見ることができた（図４ａ、挿入図）。ＭＭＰ−１３消化したウシ軟骨の培地における２８ｋＤａの断片を、次に、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによって（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ドメインであると同定した。それは、ＩＬ−１で刺激したウシ軟骨の培地において以前に見られたものと同じである、最もＣ末端のペプチド（ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８）（配列番号１）を含んでいた。
【００３９】
１６日目のＩＬ−１で刺激したウシ軟骨、及びＭＭＰ−１３消化したウシ軟骨の両方の培地において見られた５０ｋＤａの断片は、ＮＣ４及びＣＯＬ３ドメインに由来するペプチドを含むことが示された。本発明者らによる分析の前に、軟骨のＩＬ−１処理及びＭＭＰ−１３処理の両方で放出された５０ｋＤａの断片の予備分析により、両方のケースにおいて、ＣＯＬ３ドメインのＣ末端部分において生じた同一のＣ末端切断ペプチド（３つのヒドロキシル化＊残基を有する、Ｒ３８７ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ（配列番号３））が明らかになった。コラゲナーゼであるＭＭＰ−１３が、ＩＬ−１処理した試料においてもこの切断を誘導した可能性がある。規定された１つ目の基質部位がコラゲナーゼのための基質部位に相当し、２つ目がゼラチナーゼなどの異なる酵素のためのものであるため、ＩＬ−１で刺激した軟骨における切断を実際に生じさせた酵素はＭＭＰ−１３であると考えられる。ＭＭＰ−１３は、これらの２つの活性を有することが知られている酵素に相当する。
【００４０】
組織成熟における段階としてのＩＸ型コラーゲンの除去は、初期の研究において論じられている（５８、５９）。後者は、ＮＣ４ドメインが鉱化の開始時に除去されたこと、並びに、鉱化が進むにつれ、ＩＩ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲンの両方がマトリックスから除去されたことを報告した。切断は同定されておらず、それが本発明において観察された切断のいずれかと同一であったか結論を出すのは不可能である。肥大軟骨細胞におけるＭＭＰ−１３の存在は、ｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションを用いてこれまでに観察されている（６０、６１）。本発明者らによる本研究において報告された結果と組み合わせると、軟骨内骨形成における段階として、ＩＸ型コラーゲンはＭＭＰ−１３により成長プレートの原線維から除去されることが妥当であると思われる。
【００４１】
示されたデータは、モデル系における、軟骨の重要な成分の分解を解明し、ＭＭＰ−１３を、ＩＸ型コラーゲンにおける特異的な切断を達成する能力を有するプロテアーゼであると特定するものである（図９、１０）。非三重らせんの部位及び三重らせん部分に対する部位が見出された。本発明において開示される新規な部位は、切断分子のみを認識する抗体を開発するために用いることができるものであり、分子マーカー技術による新規な診断手順の開発において用いることができた。
【００４２】
ヒトにおける研究の結果
ＭＭＰ−１３でのヒト関節軟骨の消化及び新規な切断部位の決定
ヒト関節軟骨は、ウシ鼻軟骨とは対照的に、ＭＭＰ−１３消化では消化の視認可能な兆候は示さなかった。それでも、消化培地を（ＮＣ４抗血清を用いて）ウェスタンブロットで分析したところ、反応性を示した（図５ａ）。バンドは３０ｋＤの見かけの質量を有しており、それにより、そのバンドは先に記載されたウシ断片から区別された。ウェスタンブロットにおいて染色されたバンドに対応するバンドを、クマシー染色したゲルから切り出し、Ａｓｐ−Ｎ又はＧｌｕ−Ｃで消化し、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳで分析した。両方の消化物において、ＩＸ型コラーゲンα１のＮＣ４が同定され（図１１におけるＡｓｐ−Ｎの結果）、また、潜在的に新規な切断部位ＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ（配列番号６）ＮＨ２−ＴＴＤＥＲＧＰＰ−（配列番号７）に相当するペプチドが同定された。新規な切断部位は、２８ｋＤの断片において見られる、−ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８−ＣＯＯＨ（配列番号１）ＮＨ２−ＩＴＰＧＡＲＳＰ−（配列番号２）であるウシ切断部位の、５個のアミノ酸からなるＣ末端である。ウシ切断部位で切断された断片に適合する質量は、ヒト試料においては見られなかった。
【００４３】
潜在的な切断部位ペプチドの配列データを改善し、裏付けるために、ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ質量分析計を用いた。本発明者らが有しているＱｔｏｆシステムはＩｏｎＴｒａｐよりも５倍感度が低く、したがって、３つのゲルバンドをプールし、重炭酸アンモニウム緩衝液中のエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで消化してアスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）の切断Ｎ末端を得た。
【００４４】
潜在的な切断部位ペプチドに先立つか又はそれと同時の任意のペプチド溶出に対するＭＳＭＳの実施で機器が占領されることを防ぐために、限定された数のペプチド質量に対して同定及びＭＳＭＳ配列決定の実施を行うように機器を設定した（図１２）。遅く溶出することが知られている２つの内部対照ＮＣ４ペプチドと、０個又は１個のミスしたＡｓｐ−Ｎ切断を有する２つの潜在的に新規な切断部位ペプチドと、ウシ軟骨における先に同定された切断部位ペプチドと同等のヒトペプチドとを選択した。対照ペプチド及び２つの潜在的に新規な切断部位ペプチドを、ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ質量分析を用いて検出し、ここで本発明者らは、２つの後者のペプチドのＭＳＭＳデータを裏付けるためにＥＳＩ−Ｑｔｏｆ質量分析を用いることとする。Ｑｔｏｆ実験において、対照ペプチド及び新規なヒト切断部位から生じる２つのペプチドの両方を配列決定し、それらがＩＸ型配列に適合することを見出した（図５ｂに示す１つのペプチドのＭＳＭＳデータ）。ウシ切断部位ペプチドと同等のヒトペプチドはＱｔｏｆ分析においては（またＩｏｎＴｒａｐ分析においても）存在しなかった。
【００４５】
ネオエピトープペプチド抗血清（ＣＰＡ抗血清）
ＭＭＰ−１３で消化したヒト軟骨の培地のウェスタンブロットを、１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥでの消化物の分離及びネオエピトープペプチド抗血清を用いた同定により実施した。ＮＣ４に対する抗体を用いて観察されたバンドと同じ位置にあるバンドを同定した（図６）。変形性関節炎の患者から得た滑液は（関節リウマチの患者と対照的に）、アフィニティー精製したＣＰＡ抗血清を用いた阻害ＥＬＩＳＡにおいて強い阻害を示した（図８）。この実験はまた、ＳＤＳの添加が、ＣＰＡ抗血清が滑液エピトープを認識するために必須であることを示した。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ペプチドの抗血清
免疫原としての可能性を示し、ＢＬＡＳＴ検索において見られた他の配列に対する相同性を示さない、ＩＸ型コラーゲンα１のＮＣ４ドメインのＮ末端部分の１５ｍｅｒのペプチド配列を、免疫化のために選択した。配列は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、イヌ、チンパンジー、及びアカゲザルにおいて同一であり、ＩＬ−１で刺激した軟骨の培地において存在した。Ｎ末端のシステインを結合のために付加し、免疫化のための配列であるＮＨ２−ＣＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱ６４−ＣＯＮＨ２（配列番号１４）を得た。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したペプチドを用いてウサギを免疫化した。ペプチド合成及び抗体の産生は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるカスタムサービスであった。ペプチド及び抗血清は、それぞれＮＣ４ペプチド及びＮＣ４抗血清と呼ばれる。
【００４７】
（実施例２）
ネオエピトープペプチド抗血清（ヒト）
放出された（ＩＸ型）α１断片のＣ末端部分に相当するペプチド（Ｃ）−ＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ（配列番号１３）を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させ、ウサギを免疫化するために用いた。アガロースに結合したペプチドを有するカラムを用いて、抗血清をアフィニティー精製した。ペプチド合成、ペプチドカラムの作製、及び抗体の産生は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるカスタムサービスであった。
【００４８】
（実施例３）
ウェスタンブロット（ウシ）−図２、４、及び５ａ
ＭＭＰ−１３で消化したウシ軟骨の培地の試料を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動により分離し、次に、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した（３８）。ブロッキングは、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）における３％（ｗ／ｖ）低脂肪粉乳及び０．２％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０（商標）を用いて、４℃で一晩実施した。乳を除去したブロッキング溶液（上述）で膜をすすぎ、２％（ｗ／ｖ）乳、ＴＢＳ、及び０．２％Ｔｗｅｅｎ２０内に１：１０００で希釈したＮＣ４抗血清と共に、室温で１時間インキュベートした。すすいだ後、ニトロセルロース膜を、２％乳／ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０内に１：３００００で希釈したペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に室温で１時間インキュベートした。自作のＥＣＬ試薬（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を２０ｍｌ、ＤＭＳＯ内の２５０ｍＭのルミノールを４８μｌ、ＤＭＳＯ内の４０ｍＭのｐ−クマル酸を４８μｌ、及び１４μｌのＨ２Ｏ２）を用いて、ブロットを１分間活性化した。Ａｇｆａ ＣＲＯＮＥＸ５医療用Ｘ線フィルムを適当な時間にわたり膜に曝露し、Ａｇｆａ Ｃｕｒｉｘ６０で自動的に現像した。
【００４９】
（実施例４）
ウェスタンブロット（ヒト）
ＭＭＰ−１３で消化したヒト軟骨の培地のウェスタンブロッティングにおいて用いる、アフィニティー精製したネオエピトープ抗血清を、１：１００に希釈し、一方で、全ての他の条件は実施例４に記載したものである。
【００５０】
（実施例５）
阻害ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ｎｏ４４６６１２）を、ＰＢＳ内の０．１μｇ／ｍｌのＧＧＧＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ（配列番号１５）ペプチドで、多湿の箱の中で一晩、室温で被覆した。ＰＢＳ内の２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを用いてさらなる結合を遮断した。ペプチド標準（０〜１０μｇ／ｍｌ）又は変形性関節炎の滑液（１：１０、１：４０、及び１：１６０）を、０．８％ＳＤＳ、０．５％オボアルブミン、及び０．１％ブタ血清に溶解し、多湿の箱の中で一晩、室温でｓｔｅｒｉｌｉｎプレート上でプレインキュベートした。各ペプチドの濃縮及び滑液の希釈を３回繰り返した。アフィニティー精製したネオエピトープ抗血清を、４％トリトン、１％ブタ血清内に１：１０００で希釈し、プレインキュベートしたペプチド標準及び滑液と混合し、その後、Ｎｕｎｃプレートに移した。二次抗体は、１％ブタ血清内において１：１０００の、アルカリホスファターゼ（Ｄａｋｏ−３０６）に結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリンであった。１ｍｇ／ｍｌのパラジニトロフェニルリン酸を基質として用いた（９．７％のジエタノールアミン、０．０１％ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．０２％ＮａＮ３）。４０５ｎｍでの吸光度の読み取りを、基質を添加した直後に行い、次に１時間のインキュベーションの後に行った。最初の読み取り（ゼロ読み取り）を２回目の読み取りから差し引き、同様に処理したこれらのウェルから得た結果を平均化し、ペプチドの濃縮又は試料の希釈に対してプロットした。
【００５１】
（実施例６）
骨ミネラル密度を用いたＮＣ４の存在／不在を比較する研究
橈骨遠位端骨折を有する５人の閉経後の女性を研究する。患者をギプス副子で４週間治療する。前腕骨の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を、骨折の２、４、６、及び８週間後に二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）で測定する。同じ時に血清試料を採取する。ＢＭＤの結果を、血清試料におけるＮＣ４の存在又は不在と比較する。ＮＣ４の検出を実施例５に従って行う。
【００５２】
骨折部位の骨ミネラル密度は、骨折の２、４、６、及び８週間後に対照四肢から得た値の２８％、４６％、８６％、１０３％であった。５つのケースの全てにおいて、骨折部位での骨ミネラル密度の変化は、ＮＣ４の存在／不在との相関を示した。２、４、６週目の場合ではＮＣ４は検出されるが、８週目の場合には不在である。ＮＣ４の存在／不在により、いつ骨折が完全に修復されるかを正確に決定することができる。結論として、ＮＣ４の量は、骨折の治癒のモニタリングにおける新規な技術として使用することができる。
【００５３】
したがって、前述のものは、本発明の原則のみを例示するに過ぎないとみなされる。さらに、当業者は多くの改変及び変更を容易に行い得るため、示され記載された厳密な構成及び操作に本発明を限定することは望ましくなく、したがって、配列の機能上の重要ではない変異を含む全ての適切な改変及び均等物が本発明の範囲内に再分類され得、小さな変異は本明細書において説明した特定の配列に同等なものであるとみなされる。
【００５４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清及び滑液中の、ＩＬ−１が媒介するＩＸ型コラーゲンの切断断片のレベルを決定することにより、関節疾患などの結合組織を冒す障害、とりわけ、変形性関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、腱断裂、骨粗しょう症、骨軟化症、骨折修復、及び動脈硬化を検出又はモニターすることを目的とした方法に関する。より詳細には、本発明は、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮ末端部分の付近、又はより詳細にはＮＣ４ドメインのＣ末端部分の近くにある新規な切断部位、及びＮＣ３ドメインに近いＣＯＬ３ドメインにおける新規な切断部位で切断されたタンパク質断片の存在の検出又はモニタリングに関する。本発明はまた、切断により生じるネオエピトープ及びＩＸ型コラーゲンに固有のＮＣ４ドメインの切断Ｎ末端部分におけるエピトープに対するネオエピトープ抗体を開示するものである。このような方法の実施に有用な診断キット及び抗体も提示される。
【背景技術】
【０００２】
硝子軟骨のＩＸ型コラーゲンには、主要な構成要素としてＩＩ型コラーゲンを有する線維網の、主要ではない構成要素が存在する。ＩＸ型コラーゲン分子は、ポリペプチド鎖α１、α２、及びα３からなるヘテロ三量体である（２）。それは、中断された三重らせんを有する原線維結合コラーゲン（ＦＡＣＩＴ）に属する。それぞれの鎖は、４個の非三重らせんドメインであるＮＣ１、２、３、及び４に囲まれている３個の三重らせん（コラーゲン性）ドメインであるＣＯＬ１、２、及び３を含む（３）（図９も参照されたい）。ドメインの数字はＣ末端から数える。
【０００３】
電子顕微鏡法を用いて、ＩＸ型コラーゲンがＩＩ型コラーゲン原線維の表面を装飾していること、及びＮＣ４ドメインが球形構造を形成し、それが茎状のＣＯＬ３ドメインと共にＩＩ型コラーゲン原線維から突き出していることが示されている（４）。
【０００４】
ＩＸ型コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲン分子及び他のＩＸ型コラーゲン分子の両方への結合を介して、ＩＩ型コラーゲン原線維に共有結合で架橋している（５〜７）。これらの結合は、ペプチド結合を切断しない作用物質による、成熟軟骨からのＩＸ型コラーゲンの抽出を事実上不可能にする。
【０００５】
ＮＣ４ドメインは、多くの分子、例えばヘパリン及び軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）に対する親和性を有することが示されているが（８〜１０）、ＣＯＬドメインはマトリリン−３と相互作用する（１１）。相互作用するＣＯＭＰ、ＭＡＴＮ−３、及びＣＯＬ９における突然変異は、稀な遺伝性の、分布が不均一な疾患である多発性骨端異形成症を有する患者において見られており、骨端の成長及び骨化に影響する（１２）。
【０００６】
驚くべきことに、ＮＣ４断片は現在、軟骨破壊のバイオマーカーであることが示されている。切断は、軟骨の主要な構造的成分であるアグリカンが放出されてから、主要なコラーゲンが分解されるまでに生じる。Ｘ線観察のように破壊プロセスの後期段階の結果であるコラーゲンマーカーとは対照的に、ＮＣ４断片は、「引き返しの限界点」の前の破壊をもたらすプロセスのマーカーである。アグリカン関連マーカーは、分解進行の初期段階において、また組織の通常の適応化の際に放出され、したがって、病理学的プロセスを特別に示すものではない。さらに、アグリカンマーカーは炎症に関連することが多い。
【０００７】
本発明に記載されているように、ＮＣ４の切断の後、ＩＩ型コラーゲンに架橋したままであるＩＸ型コラーゲンの大部分は、さらに切断されてその後の段階において放出される可能性を有している。本明細書における発明で開示されている、放出された断片の新たなＣ末端に対するネオエピトープ抗体は、このような切断を検出することができた。加えて、本発明において開示されているネオエピトープ抗血清を免疫組織化学で用いて、本明細書において報告されている新規な切断が軟骨のどこで（表面−深部、細胞周囲−領域間）生じているかを決定することができた。組織内に最初に残存していた断片の新たに形成されたＮ末端に対する抗体は、その後の段階におけるこのような断片の放出を検出することができた。タイミングについてのさらなる情報は、ｃｏｌ３ドメインにおける切断により生じたネオエピトープを用いて得ることができた。多くの先行する刊行物及び特許出願が、ＩＸ型コラーゲンに特異的に結合するモノクローナル抗体を記載しているが、それらのいずれも、ＮＣ４付近の切断部位に特異的なネオエピトープ抗体については述べていない。
【０００８】
特許出願ＷＯ１９９０００８１９５Ａ１は、ヒトＩＸ型コラーゲン及びそれに由来する断片に免疫学的に結合するモノクローナル抗体の産生において抗原として有用な、ヒトＩＸ型コラーゲンのセグメントに対応するオリゴペプチドを開示している。しかし、この特許出願において述べられているセグメントはＩＸ型コラーゲンの病理学的破壊には関与しておらず、したがって、関節炎との関係においては期待されない。
【０００９】
Ｉｎｓｔ ｏｆ Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＹに譲渡されたＷＯ２００４１１０４７５Ａ１において、発明は、関節炎の症状を有する個体に対する治療及び耐性誘導のための、ＮＣ４ドメインを含む組成物に関するものである。発明者らはまた、抗関節炎活性又は抗炎症活性を有するポリペプチドを結合組織から回収するための方法を記載している。上記の特許出願のように、抗体は、切断されていないＩＸ型コラーゲンに対するものであり、ネオエピトープ抗体ではない。さらに、出願人らは、ＮＣ４を診断のためのマーカーとしては述べていない。
【００１０】
Ｆｉｂｒｏｇｅｎ Ｉｎｃに譲渡された特許出願ＷＯ１９９９０２１０１１Ａ１は、血清中のＩＸ型コラーゲンのレベルを決定することにより自己免疫障害及び結合組織障害を検出又はモニターするための方法を明らかにしている。ＩＸ型コラーゲンに対する抗体を調製する際に、ＮＣ４ドメインのＮ末端部分における配列が選択された。この抗体は、切断されていないＩＸ型コラーゲンに対するものであり、本明細書の発明におけるような、固有の切断ネオエピトープに対するものではない。
【００１１】
先行文献のいずれも、ＮＣ−４ドメインの排他的な放出をもたらす、このドメインにおいて生じる特定の切断部位については記載していない。組織が特定の疾患において完全に破壊されるという事実にも関わらず、切断の特徴は推測又は予測することができない。とりわけ配列の類似性の観点から、ウシ軟骨及びヒト軟骨において分子の切断が異なることも予想されなかった（図１０）。
【００１２】
したがって、特定の切断部位の発見は新規であり、新たな診断発明を開拓するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明者らは、滑液、血清、尿、及びあらゆる体液などのあらゆるヒト試料におけるＩＸ型コラーゲン破壊の分析を容易にする、同定された新規な切断部位に対する方法として、高感度のウェスタンブロット技術及び高感度の阻害ＥＬＩＳＡを開発した。この種のアッセイは、同定された切断が、患者における軟骨の分解及び関節の劣化において出現するかどうか、並びにいつ出現するかを明らかにするために用いることができた。本明細書の発明の特異的なネオエピトープ抗体を用いることで、アッセイを、疾患の進行の診断及び治療に対する疾患の応答のモニタリングに用いることができる。例えば、骨折の治療中のスポーツマンに対して、トレーニングプログラムを再開する最適な時期を決定するためである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
インターロイキン−１誘導性のウシ鼻軟骨の分解を用いて、１６日間にわたり組織における異化事象を研究した。培地を２Ｄ電気泳動（等電点電気泳動法及びＳＤＳ ＰＡＧＥ）によって分画化した。ペプチドマスフィンガープリンティングによる成分の同定により、１２日目及び１６日目に、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮＣ４ドメインなどのタンパク質断片の放出が明らかになった。
【００１５】
ＮＣ４ドメインのＮ末端部分におけるエピトープに対する新規なペプチド抗体は所見を裏付けるものであり、既に９日目に、断片の１つが存在することを示した。
【００１６】
２つの最も豊富な断片の質量分析により、最も小さい断片が、配列内のアルギニン−２５８とイソロイシン−２５９との間で切断されてＣ末端ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ−（配列番号１）及びＮ末端−ＩＴＰＧＡＲＳＰ（配列番号２）（ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−ＩＴＰＧＡＲＳＰ）を生じさせる、ほぼ完全なＮＣ４ドメインを含むことが明らかになった。
【００１７】
大きい方の断片は、ＮＣ４ドメインと、ＮＣ３ドメインに近い、Ｃ末端ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ−（配列番号３）及びＮ末端−ＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号４）（ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ及び−ＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ）を生じさせる、ＣＯＬ３におけるグリシン−４００とスレオニン−４０１との間に位置する切断部位を有するＣＯＬ３ドメインとを含む。複数の（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮ末端配列の存在は、放出された分子が、ＩＬ−１処理の前に、又はその処理によって、元のＮ末端に非常に近い部位で切断されていることを示している。
【００１８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ−１３）がこの期間において活性であり、フィブロモジュリンを切断することが示されている（１）。ＭＭＰ−１３で処理した軟骨移植片は、ＩＬ−１処理で得られるものと同じサイズ及び同じ切断部位を有する（ＩＸ型）コラーゲンα１断片を放出することが示された。示されたデータは、ＭＭＰ−１３を伴うと考えられる潜在的に重要な分解事象、及び最終的なＩＩ型コラーゲンの損失に先行する分解事象を説明するものである。
【００１９】
ヒト軟骨におけるＩＸ型コラーゲンの切断のさらなる研究により、ＮＣ−４ドメインにヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖の特異的な切断部位もあったが、これは驚くべきことにウシコラーゲンのものとは異なる部位に生じたことが明らかになった。ＮＣ−４ドメインにおける、ヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖のＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱＴＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号５）におけるグルタミン−２６３とスレオニン−２６４との間の部位における切断により、Ｃ末端ＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ−（配列番号６）及びＮ末端−ＴＴＤＥＲＧＰＰ）（配列番号７）（−ＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−ＴＴＤＥＲＧＰＰ）が生じる。ＣＯＬ３ドメイン内の部位に相当する大きい方の断片は、ウシ及びヒトの軟骨に由来するもので同じサイズであり、ウシにおけるＳ３９９がヒトＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００ＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号８）においてはＲ３９９に交換されているにもかかわらず、切断は同じ部位、すなわちＧ４００とＴ４０１との間で生じる。ヒトＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００ＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号８）の切断の結果、２つのネオエピトープＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ（配列番号９）及びＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号１０）が生じる。ヒトＮＣ−４及びＣＯＬ３の新たなネオエピトープ末端の全てに対する抗体が、標準的な方法を用いて開発され、切断断片との特異的な反応性を示した。抗体を用いて、エピトープを検出するためのＥＬＩＳＡを開発した。これらのＥＬＩＳＡを用いて、関節疾患などの結合組織を冒す障害、とりわけ、変形性関節炎、並びに関節リウマチ、腱断裂、骨折修復、及び動脈硬化を有する患者から得た滑液におけるエピトープの存在を示した。本発明の特徴は、本発明を限定するものとは解釈されない以下の実施例を参照することにより、より明瞭に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分離した、１６日目の、ＩＬ−１で刺激したウシ鼻軟骨培地から得たタンパク質を示す図である。一次元目である等電点電気泳動は３〜１０のｐＨ範囲にわたるものであり、二次元目は４〜２０％の勾配ゲルを用いた。画像の左側の数字は参照マーカータンパク質の位置を示す。輪で印を付けたスポットは、（ＩＸ型）コラーゲンα１であると同定されたスポットを示す。異なるＩＸ型コラーゲン断片は、本文中において、２８ｋＤａ断片、５０ｋＤａ断片、及び１００ｋＤａ断片であるとみなされている。画像において、分析した特定のスポットの例に５、８、及び１４と印を付けている。これらのスポットのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）の結果を、以下の図１１ａ、ｂ、及びｃに示す。
【図２】ＩＬ−１で刺激した軟骨移植片の、ＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットを示す図である。ＩＬ−１で刺激した軟骨培養物の６日目、９日目、１２日目、及び１６日目の培地を、１Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離した。２８ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び５０ｋＤａの見かけの質量での陽性シグナルが明瞭に視認可能である。
【図３】２８ｋＤａのＮＣ４断片の最もＣ末端のペプチドから得たタンデム質量分析のデータを示す図である。２８ｋＤａの断片をＡｓｐＮでゲル内消化し、ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化−四重極飛行時間型質量分析）を用いてオンラインで逆相ＬＣ（液体クロマトグラフィー、Ｃ１８カラム）で分析した。推定されるペプチド配列はＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）である。ＩＬ−１で刺激した軟骨から得た培地（１６日目）をまず、２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。この注釈付きのスペクトルは、ＢｉｏＬｙｎｘソフトウェア（ペプチド配列決定、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｊｕｐｄａｌｓｖａｇｅｎ １２−１４ Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ Ｓｗｅｄｅｎ）において生じたものであった。ペプチドのデルタ質量は＜０．０１Ｄａであり、ｙイオンの平均誤差は０．０１Ｄａであり、強度の閾値は０．７５％に設定した。
【図４ａ】ＮＣ４抗血清を用いた、ＩＬ−１及びＭＭＰ−１３で処理した軟骨の培地のウェスタンブロットを示す図である。ＩＬ−１（１６日目）又はＭＭＰ−１３で処理したウシ鼻軟骨から放出されたタンパク質を１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離した。クマシーブルーＧ−２５０で染色したゲル上の同等の位置を切り取り、ゲル内消化し、ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析）を用いてオンラインで逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８カラム）で分析した。両方の２８ｋＤａの断片が、同一の最もＣ末端のペプチドＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）を含んでいた（図３参照）。５０ｋＤａの断片は、Ｐ＊がヒドロキシプロリンである、共通の最もＣ末端のペプチドＲＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ（配列番号３）を共有していた（図４ｂ参照）。右側の挿入図は、４０ｋＤａのバンドを示す、同一のブロットの過剰曝露のバージョンである。
【図４ｂ】ウシＩＸ型コラーゲンの５０ｋＤａの断片における最もＣ末端のペプチドのタンデム質量分析を示す図である。５０ｋＤａの断片をトリプシンでゲル内消化し、ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳＭＳを用いてオンラインで逆相クロマトグラフィーで分析すると、最もＣ末端のペプチド（Ｐ＊がヒドロキシプロリン残基であるＲＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ（配列番号３））のタンデム質量分析のデータが見られた。ＭＭＰ−１３消化溶液を１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーＧ−２５０で染色した。この注釈付きのスペクトルは、ＢｉｏＴｏｏｌｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ、Ｐｏｌｙｇｏｎｖａｇｅｎ ７９ Ｔａｂｙ Ｓｗｅｄｅｎ）において生じたものであった。許容誤差は０．２Ｄａであり、ｂイオン及びｙイオンの平均誤差は０．０６Ｄａであり、強度の閾値は１０に設定した。
【図５ａ】ＭＭＰ−１３又はＩＬ−１で処理したヒト軟骨の、ＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットを示す図である。ヒト関節及びウシ鼻軟骨をＭＭＰ−１３で消化し、後者はＩＬ−１での刺激も行った（１６日目）。消化溶液及び培地を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分離した。
【図５ｂ】ヒトＮＣ４断片の最もＣ末端のペプチドのタンデム質量分析のデータを示す図である。断片をＡｓｐ−Ｎでゲル内消化し、ＬＣ−Ｑｔｏｆ ＭＳで分析した。ロイシン及びイソロイシンは正確な同一の質量を有しており、したがって、スペクトルにおけるＬはＬ又はＩに相当する。推定されるペプチド配列はＥＴＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１１）である。ＭＭＰ−１３で消化した軟骨の培地を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分画化し、その後、質量分析を行った。
【図６】ＭＭＰ−１３で消化したヒト関節軟骨の培地の、ネオエピトープ抗血清を用いたウェスタンブロットを示す図である。ヒト関節軟骨をＭＭＰ−１３で消化した。消化溶液を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分離し、電気泳動でニトロセルロース膜に移し、それを、全ての変異体を認識するＮＣ４における内部エピトープに対するウサギ抗血清（右パネル）、及び左パネルの、ＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３に対するネオエピトープ抗体とインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体で検出した。切断部位全体にわたる連続的な配列を含む大きい方の断片とのネオエピトープの反応性がないことは、切断断片に対する特異性を示している。
【図７】非トリプシン性のＮ末端切断を示す、ＮＣ４ドメインにおけるペプチドＳＮＳＤＧＥＮＥＬＣＰＫ（配列番号１２）のタンデム質量分析データ（ＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴｏｆ ＭＳ）を示す図である。バンドをゲルから切り取り、トリプシンで消化し、その後、オンラインでＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳを用いた逆相クロマトグラフィーを行った。ペプチドを脱アミド化して、このペプチド配列におけるＤ（アスパラギン酸塩）がウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９）においてはＮ（アスパラギン）となるようにする。この注釈付きのスペクトルは、ＢｉｏＬｙｎｘ（ペプチド配列決定、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｊｕｐｄａｌｓｖａｇｅｎ １２−１４ Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ Ｓｗｅｄｅｎ）において生じたものである。ペプチドのデルタ質量は０．０１Ｄａであり、ｙイオンの平均誤差は＜０．０２Ｄａであり、強度の閾値は２％に設定した。同一の実験のデータを図１２ｃに示す。
【図８】図８Ａは、ＳＤＳの存在下及び不在下でＲＡ試料及びＯＡ試料を比較する、ネオエピトープ抗血清を用いる免疫アッセイを示すグラフである。１つのＲＡ患者及び１つのＯＡ患者から得た滑液を、ＳＤＳの存在下又は不在下で分析した。試料は、１：１０、１：４０、及び１：１６０に希釈した。図８Ｂは、４〜１６％ゲル上でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、その後、電気泳動でニトロセルロース膜に移し、ＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１３）切断ネオエピトープに対する抗体を用いて染色した、関節疾患を有する患者から得た滑液試料のウェスタンブロットを示すグラフである。結合したＩｇＧを、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出した。ネオエピトープを含む、選択滑液における２０ｋＤａの断片の存在に注目されたい。この断片は、ＭＭＰ−１３消化の際に関節軟骨から放出された断片よりも多少小さいものである。
【図９】示した切断部位を有するＩＸ型コラーゲン分子の概略図である。細い線は非コラーゲンドメイン（ＮＣ）に相当し、太い線はコラーゲンドメイン（ＣＯＬ）に相当する。矢印は、同定され記載されている切断部位の位置を示している。
【図１０】それぞれ、ヒト及びウシの軟骨におけるＩＸ型コラーゲンの切断配列を示す図である。
【図１１ａ】図１の２Ｄゲルから得たスポット５の、ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示す表である。Ｍａｓｃｏｔペプチドマスフィンガープリントソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたデータベース検索の結果、（ＩＸ型）コラーゲンα１が同定された。ＮＣ４ドメインから得たペプチドのみがスペクトルにおけるピークに適合した。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。Ｍ（ｅｘｐｔ）は、ペプチドの測定されたモノアイソトピック質量であり、Ｈは水素であり、「デルタ」は、適合ペプチドの、測定された質量と理論的に計算された質量との間の差を意味する。「ミス」は、適合ペプチド配列内にどれだけ多くのミスした切断が存在するかを示す。「配列」は、Ｎ末端及びＣ末端の両方にハイフンで分離された１つの余分なアミノ酸を有する適合ペプチドの配列を示す。「修飾」は、質量分析で得られたＭ（ｅｘｐｔ）にペプチド配列を適合させるために必要な、ペプチド配列における修飾を説明するものである。認められた修飾（変動的）は、メチオニンの酸化、及びヒドロキシプロリンを形成するためのプロリン残基のヒドロキシル化であった。システイン残基はリストされなかったため、全てのシステイン残基はカルバミドメチル化されたと考えられた。
【図１１ｂ】図１の２Ｄゲルから得たスポット８の、ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示す表である。その後、Ｍａｓｃｏｔペプチドマスフィンガープリントソフトウェアを用いてデータベース検索を行った結果、（ＩＸ型）コラーゲンα１が同定された。ＮＣ４ドメイン及びＣＯＬ３ドメインの両方におけるペプチドがスペクトルにおけるピークに適合した。ＭＭＰ−１３処理した軟骨移植片から放出された５０ｋＤａの断片を分析した後（図４）、このスペクトルを、切断部位のペプチドに適合するピークの存在について調べた。それはこれらのＭＡＬＤＩデータにおいても存在した（観察された質量＝１２７４．６２８）。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。表の説明については図１１ａにおける記載を参照されたい。
【図１１ｃ】図１の２Ｄゲルから得たスポット１４の、ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示す表である。その後、Ｍａｓｃｏｔペプチドマスフィンガープリントソフトウェアを用いてデータベース検索を行った結果、（ＩＸ型）コラーゲンα１が同定された。ＮＣ４ドメイン、ＣＯＬ３ドメイン、及びＣＯＬ２ドメインから得たペプチドがスペクトルにおけるピークに適合した。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。表の説明については図１１ａにおける記載を参照されたい。
【図１２ａ】Ｍａｓｃｏｔ「ＭＳＭＳ ｌｏｎｓ ｓｅａｒｃｈ」（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたデータベース検索に従った、ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１に適合するペプチドを示す表である。２８ｋＤａの断片を２Ｄゲルから切り出し、ＡｓｐＮでゲル内消化し、ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳ／ＭＳと共にオンラインで逆相ナノＬＣを用いて分析した。これは、図３に示したものと同一の実験から得られたデータである。「Ｍ（ｅｘｐｔ）」は、適合ペプチドのモノアイソトピック質量を意味し、そうでなければ、この表記は図１１におけるものと同一である。イオンスコアは、観察された適合がランダムヒットである可能性に基づくものである（４１）。値が大きいほど良好なヒットであることを示す。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。
【図１２ｂ】２８ｋＤａのウシ断片のＡｓｐＮ消化物において、推定される、トリプシンにより生じる部位が不在であることを示す表である。図３及び図１２ａと同一の実験であるが、推定される「トリプシン性」ペプチドに適合するＡｓｐＮ消化物においてペプチドについて検索したところ、切断部位のペプチドが明らかになった。トリプシン消化に典型的な他のペプチドは同定されなかった。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。
【図１２ｃ】２８ｋＤａのバンドにおける、ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１に適合するペプチドを示す表である。２８ｋＤａのバンドを２Ｄゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化し、Ｑｔｏｆセットアップを用いて分析し、データを用いてＭａｓｃｏｔ「ＭＳＭＳ Ｉｏｎｓ ｓｅａｒｃｈ」でＮＣＢＩ ｎｒデータベースの検索を行った。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする（図７）。「修飾」は、質量分析で得られたｍ／ｚにペプチド配列を適合させるために必要な、ペプチド配列における修飾を説明するものである。認められた修飾（変動的）は、メチオニンの酸化、脱アミド化（アスパラギン及びグルタミン）、並びにヒドロキシプロリンであった。システイン残基はリストされなかったため、全てのシステイン残基はカルバミドメチル化されたと考えられた。
【図１３】ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１鎖に適合するペプチドを示す表である。５０ｋＤａの、ＭＭＰ−１３により生じた試料を１Ｄゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化し、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳセットアップを用いて分析した。データを、Ｍａｓｃｏｔ「ＭＳＭＳ Ｉｏｎｓ ｓｅａｒｃｈ」を用いるデータベース検索によりさらに分析した。これは、図４ｂと同一の実験から得られたデータであった。適合したペプチドを、ウシ配列ｇｉ｜１１９９０１０５９に関する開始位置及び終了位置と共に表にする。表の説明については図１２ａ及び１２ｃを参照されたい。
【図１４】３０ｋＤａの断片における（ＩＸ型）コラーゲンα１に適合するヒトペプチドを示す表である。１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離したＭＭＰ−１３消化培地から得た、Ａｓｐ−Ｎ消化した３０ｋＤａのバンドのＩｏｎＴｒａｐ分析から得られたデータベース検索の結果である。
【図１５】「含有質量リスト」を示す表である。（ＩＸ型）ヒトコラーゲンα１のＮＣ４のアミノ酸配列に由来する５つのペプチド質量を、逆相ＬＣ ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ ＭＳセットアップによるＭＳＭＳ分析のために選択した。最初の２つは、ＭＭＰ−１３消化培地の３０ｋＤａのバンドのＡｓｐ−Ｎ消化物において見られた、２つの最もＣ末端のペプチドである。３つ目及び４つ目は、平行して実施した逆相ＬＣ ＥＳＩ．ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによって容易に検出され、対照として含まれた。最後の５つ目は、切断部位がウシにおけるものと同一である場合に予想されるＣ末端ペプチドに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
まずウシでの研究について考察し、さらに、ヒトにおいて本発明の詳細について記載する。
【００２２】
ウシ鼻軟骨のインターロイキン−１誘導性の分解により、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮＣ４ドメインなどの断片の放出が明らかになった。ＮＣ４ドメインのＮ末端部分におけるエピトープに対する本発明の新規なペプチド抗体により、その所見が裏付けられた。
【００２３】
２つの最も豊富な断片の質量分析により、最も小さい断片が、配列ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）（−ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８−ＣＯＯＨ）及び−ＩＴＰＧＡＲＳＰ（配列番号２）（ＮＨ２−ＩＴＰＧＡＲＳＰ）においてアルギニン−２５８とイソロイシン−２５９との間の新規な部位で切断される、ほぼ完全なＮＣ４ドメインを含むことが明らかになった。大きい方の断片は、ＮＣ４ドメインと、ＮＣ３ドメインに近い、ＣＯＬ３におけるグリシン−４００とスレオニン−４０１との間に位置する新規な切断部位、ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ−（配列番号３）（ＲＧＰＰ（ＯＨ）ＧＰ（ＯＨ）ＰＧＰＰ（ＯＨ）ＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ）及びＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号４）（ＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ−）を有するＣＯＬ３ドメインとを含んでいた。
【００２４】
ウシでの研究の結果
ウシのアミノ酸配列
この研究における質量分析に適合したウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１のアミノ酸配列は、「国立生物工学情報センター」（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の非冗長（ｎｒ）データベースにおいて、ｇｉ｜１１９９０１０５９（２２−Ｄｅｃ−０６）という名前で見ることができる。ヒト（ＩＸ型）α１配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ２０８４９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／）との、ＮＣＢＩから得たこの配列のアラインメントにより、Ｎ末端及びＣ末端の主な相違が明らかになる（付録１）。ウシ配列のＮ末端部分はヒト配列よりも３３２アミノ酸長い。この研究において、全ての質量分析データはこの「付加的な」配列のいずれの部分にも適合しなかった。ウシの配列は、ヒトの対応物の最初の６４２個のアミノ酸に対して９０％の類似性を示すが、Ｃ末端における２７９個のアミノ酸は存在しない。このウシ配列は、置換されるべきアーチファクトであると考えられる。したがって、本発明者らは、本明細書においてはヒトの配列を参照して数字の注釈を付けることを選択した。データベース検索の結果は、それらのウシ配列での数字を維持している。
【００２５】
ウシ鼻軟骨移植片の培養
ＩＬ−１で刺激した軟骨移植片から得た培地に放出されたタンパク質（３、６、９、１２、及び１６日）を、２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分離し、ペプチドマスフィンガープリンティングを介して同定した。３日目及び６日目に得たゲルは、とりわけ最上部で不規則な分離を示し、これは、ゲル内に入るには大きすぎる、インタクトな断片化されたアグリカンを大量に含む試料に典型的である。このプロジェクトにおいて、アグリカンが放出された後、しかし主要なコラーゲン放出の前に生じる、その後の分解が焦点であった（４２）。（ＩＸ型）コラーゲンα１は、１２日目及び１６日目から得た培地の２Ｄゲル上では、異なる位置で同定された（典型的なゲルを図１に示す）。ＩＬ−１の不在下でインキュベートした対照試料においては、同じスポットは存在していなかった（データは図示していない）。速く移動したタンパク質スポットの組は２８ｋＤａの見かけの質量を有しており、ペプチドマスフィンガープリンティングにより見られる配列包括度（１３個のピークがペプチドに適合、図１１ａ）により、それらが（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ドメインの主要な部分に相当することが示された。約５０ｋＤａの見かけの質量で移動する（ＩＸ型）コラーゲンα１断片のペプチドマスフィガープリンティングにより、ペプチドに適合した２３個のピークが明らかになり（図１１ｂ）、そのうちの１０個はＣＯＬ３ドメインに由来するものであり、残りはＮＣ４に由来するものであった。（ＩＸ型）コラーゲンα１と同定された、最も遅く移動するスポット（１００ｋＤａの見かけの質量）のペプチド包括度は、ＮＣ４及びＣＯＬ３に加えて、ＣＯＬ２ドメインの一部を含んでいた（２５個のピークがペプチドに適合、図１１ｃ）。これは架橋部分又は全サイズの（ＩＸ型）コラーゲンα１に相当するものであり得、さらなる研究は行わなかった（未知のウシＣ末端配列）。
【００２６】
ペプチド抗体
同定された（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の研究を裏付けるため、またその研究をさらに可能にするために、（ＩＸ型）α１のＮＣ４ドメインのＮ末端部分から得たペプチド（ＮＨ２−ＣＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱ６４−ＣＯＮＨ２）（配列番号１４）を、添加した、キーリンペットヘモシアニンに結合したシステインを用いて合成し、ウサギを免疫化するために用いた。このＮＣ４抗血清は、固相ＥＬＩＳＡにおいてＮＣ４ペプチドへの結合を示した（力価１：５００００）。結合はＮＣ４ペプチドを添加することにより阻害された。０．３ｎｇ／ｍｌのペプチド濃度は、結合の効率的な阻害を示した。
【００２７】
ウェスタンブロット
ポリクローナルＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットにより、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離された、ＩＬ−１で刺激した軟骨培養物から得た培地において、２８ｋＤａ及び５０ｋＤａで（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の存在が裏付けられた。４０ｋＤａに対応する位置にさらなるバンドがあることにより、他の２つよりも多少早く最初に放出された別の（ＩＸ型）コラーゲンα１要素の存在が示された（図２）。これらの３つの断片は、それぞれ２８ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び５０ｋＤａの断片であるとみなされる。
【００２８】
切断部位の同定
ＩＬ−１で刺激したウシ鼻軟骨から得た培地内に放出された（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の存在を受けて、本発明者らは切断部位を探求した。２８ｋＤａの断片を含む２Ｄゲルの切片をトリプシン又はＡｓｐＮで処理し、その後、ＬＣ ＭＳＭＳ（Ｑｔｏｆ）を行った。ＮＣＢＩ非冗長（ｎｒ）、カルバミドメチル（Ｃ）、変動的な酸化（Ｍ）、及び変動的なヒドロキシル化（Ｐ、Ｋ）を用いたＭａｓｃｏｔデータベース検索（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ、ＵＳＡ）では、ＮＣ４ドメインからのペプチドが同定されただけであった。トリプシン消化した試料及びＡｓｐＮ消化した試料の両方において見られた最もＣ末端のペプチドはＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）であった（図３）。これは、トリプシンにより両端で正確に切断されたペプチド、及びＡｓｐＮによりＮ末端は正確に切断されているがＣ末端の切断はプロセシングの前に別の酵素により媒介されなくてはならないペプチドに相当する。図２ａ及び２ｂにおいて、ＡｓｐＮ消化された試料から得たＭＳＭＳデータに適合するペプチドを表にする。トリプシンの特異性を用いた、ＡｓｐＮ消化物におけるペプチドについてのＭａｓｃｏｔ ＭＳＭＳ Ｉｏｎ ｓｅａｒｃｈは、「切断」ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）ペプチドのみを示し、このことは、同定された断片に対してトリプシンの攻撃がなかったことを示していた。２８ｋＤａのスポットのトリプシン消化物は、他のＮＣ４ペプチドに加えて、アミノ酸Ｐｈｅ３１−Ｌｙｓ４６、Ｖａｌ３３−Ｌｙｓ４６、及びＳｅｒ３５−Ｌｙｓ４６をそれぞれカバーする３つのＮ末端ペプチドを含んでいた（図１２ｃ及び図７）。後者の２つは共にＮ末端に非トリプシン切断を有しており、このことは、２つの新たなＮ末端が存在していることを示している。異なるＮ末端の存在は、コラゲナーゼ消化後に単離されたＮＣ４においてこれまでに報告されているが（４３、４４）、本発明者らは自らの一連のデータにおいてこれらの切断を全く観察しなかった。
【００２９】
５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片をトリプシンでゲル内消化し、逆相ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによって分析した。９個のペプチドを配列決定し、それらは、最もＣ末端のペプチド（ＲＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ４００）（配列番号３）が、用いたトリプシンによっては生じないＣ末端切断を有している（Ｐ＊はヒドロキシプロリン残基を示す。データは図示していない）、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４−ＣＯＬ３ドメインに適合した。
【００３０】
主要ではない４０ｋＤａの断片を、ＮＣ４ドメインのみに配列切断を有する（ＩＸ型）コラーゲンα１として同定した。それについてはさらなる研究は行わなかった。
【００３１】
ウシ鼻軟骨のＭＭＰ−１３消化
ＭＭＰ−１３を用いてウシ鼻軟骨を２４時間消化すると、ＩＬ−１でのインキュベーションと同様、軟骨に視覚的影響があり、組織が透明になり始めた。ＮＣ４抗血清を用いた培地のウェスタンブロットにより、ＮＣ４ドメインを含む２つの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片が存在することが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、抗ＮＣ４ペプチド抗血清を用いたウェスタンブロットにより示されるように、それらは一様に２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの断片に移動した（図４ａ）。長時間曝露すると、ＩＬ−１処理した軟骨から得た培地において見られるものに類似した、弱い４０ｋＤａのバンドも出現した（図４ａ、挿入図）。クマシー染色したゲルから得た２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの２つのバンドを有するゲル切片を、それぞれＡｓｐＮ及びトリプシンで消化した。逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによる分析により、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮ末端断片を同定した。２８ｋＤａの断片において見られた最もＣ末端のペプチドはＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）であり、これは、１２日目及び１６日目の、ＩＬ−１で刺激したウシ軟骨培地試料におけるものと同じペプチドである（図３）。ＭＭＰ−１３により生じた５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片について（逆相ＬＣ ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳにより）同定されたペプチドを図１３にリストする。最もＣ末端のペプチドは、トリプシンによっては生じないＣ末端切断を有しており（図４ｂ）、このことは、新たに同定された切断部位を示している。同一のペプチドが、別のＣＯＬ３ドメインペプチドに加え、ＩＬ−１処理した軟骨の試料において検出された（データは図示していない）（同一のｍ／ｚ、荷電状態、及び保持時間がＭＭＰ−１３試料において見られたが、ＭＳＭＳは実施しなかった）。
【００３２】
考察
軟骨の分解がＩＬ−１の刺激により誘発される、関節疾患における組織破壊のこのモデルは、組織高分子の断片化及び放出の研究において頻繁に使用されている。アグリカン断片が最初に放出され、その後にＣＯＭＰ、フィブロモジュリン、そして最後にコラーゲンが放出されることが示されている（４５〜４７）。ＩＬ−１の存在下において培養した軟骨から得た培地において、本発明者らは、２Ｄゲル電気泳動を用い、その後ＭＡＬＤＩ ＭＳを行うことによって、（ＩＸ型）コラーゲンα１断片の放出を見出した。２８ｋＤａの見かけのＭＷを有する、２Ｄゲル上で検出された最も豊富な断片は、球形のＮＣ４ドメインの大部分に相当するものであった。等電点の大きなインターバルにわたる２Ｄゲル上の２８ｋＤａの断片のスポットの移動は、アスパラギン残基の脱アミド化による可能性がある（４８）。実際、配列決定されたペプチドの１つは脱アミド化を示すと考えられた（図７）。この現象についてのさらなる調査は行わなかった。大きい方の５０ｋＤａの断片は、ＮＣ４、及びＣＯＬ３ドメインの大部分を含むことが示された。
【００３３】
ＩＸ型コラーゲンのドメインＣＯＬ１、ＣＯＬ２、ＮＣ１、及びＮＣ２がＩＩ型コラーゲン原線維と強く結合している一方で、ＣＯＬ３及び球形のＮＣ４は線維表面から突き出している（４９）。ＩＸ型コラーゲンのこの部分は、ＩＩ型原線維と他の細胞外構造要素との間のコネクターとしての役割を果たし得る。裏付けとして、ＩＸ型コラーゲンが不在であると、軟骨は、病原性抗体による自己免疫攻撃に対してより脆弱になり得（５０）、マトリリン−３を保持するその能力が低下する（５１）ことが最近示された。したがって、ＩＸ型コラーゲンの断片化及び組織からの機能的ＮＣ４ドメインの喪失は、軟骨の解体のプロセスにおける重要な初期の段階を反映するものである。
【００３４】
上述した、（ＩＸ型）コラーゲンα１ペプチド抗体は、ＮＣ４ドメインのＮ末端に近い配列に相当する合成ペプチド（Ｃ）ＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱ６４（配列番号１４）に対するものであった。このペプチドを、ＮＣ４ドメインに対する抗体に対する免疫原として以前に用いたペプチドのＣ末端となるように選択したが（５２）、それは、これらの筆者が、彼らが用いた免疫原配列内にいくつかが位置している、複数のＮ末端の存在を記載していたからである。それらの抗体は、とりわけ成長プレートにおけるＩＸ型コラーゲンの変化を記載するために用いられている（５３〜５６）。本発明者らの質量分析データもまた、ＮＣ４ドメインのＮ末端での複数の切断の存在を示したが（１２ｃ及び図７）、そのいずれも、これまでに記載されているものに対応しない。これらの切断がＩＬ−１による刺激の結果であるか、又はこれらが刺激の前に組織内に既に存在しているかは分かっていない。
【００３５】
本発明者らによる新規なＮＣ４抗血清を用いたウェスタンブロットにより、９日目、１２日目、及び１６日目の培地において３つの異なるＩＸ型コラーゲン断片が存在することが明らかに示された（図２）。そのうちの２つの見かけの質量は、約２８ｋＤａ及び５０ｋＤａに対応する、２Ｄゲルから以前に同定されたスポットに適合する。４０ｋＤａの見かけの質量を有する３つ目の断片は、９日目の培地において既に見られた。１２日目のＩＬ−１で刺激した軟骨から得た培地において見られた４０ｋＤａの断片をトリプシン消化及び質量分析すると、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ドメインが同定された。見かけの質量は、ＮＣ４ドメインよりも大きな断片を示唆しているが、質量分析のデータは限定された包括度を示し、ＣＯＬ３ドメインのペプチドを全く含まなかった。最も豊富な２８ｋＤａの断片を選択して、さらに広範囲な特徴付けを行った。大きい方の断片は、コラーゲンドメインと、プロリン残基のヒドロキシル化におけるそれらの不均一性と、トリプシンなどの酵素によるプロリンのＮ末端の切断の困難性とから、研究するにはより複雑であると予想された。
【００３６】
エレクトロスプレー質量分析（ＬＣＭＳＭＳ）を用いたオンラインの逆相液体クロマトグラフィーと組み合わせた、トリプシン及びエンドプロテアーゼＡｓｐＮでの消化により、ＣＯＬ３ドメインに対する少数のアミノ酸からなるＮ末端である、ＮＣ４のＣ末端部分における新たな切断が明らかになった。トリプシンを用いて見出された最もＣ末端の断片はＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８（配列番号１）であった（ｌ）。Ｃ末端に加えて、ペプチドをカバーする部分を探求するために、ＮＣ４を含む断片をＡｓｐＮで切断した。この酵素はＰＡＲ２５８とそれに続くイソロイシンとの間の切断を生じさせないにもかかわらず、ＡｓｐＮは、トリプシンと同一の、最もＣ末端のペプチドＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８を生じさせた（図３）。ＡｓｐＮ消化物は、トリプシンによる汚染を除き、トリプシンにより生じ得るいかなる他のペプチドも含んでいなかった。別の対照として、長い方の５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片のＡｓｐＮ消化は、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳで検出可能なＥＴＣＮＥＬＰＡＲ（配列番号１）ペプチドを生じさせず、一方、トリプシンは、アルギニン残基で実際に切断してこの断片を生じさせた（データは図示していない）。５０ｋＤａの（ＩＸ型）コラーゲンα１断片をトリプシン消化し、その後、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐＭＳで分析すると、１６日目のＩＬ−１から得た培地においてＣＯＬ３ドメインにおける２つのペプチドが同定された。それらのうち最もＣ末端のものは、Ｃ末端の非トリプシン切断（−ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ（配列番号３）、ＮＨ２−ＴＩＧＦＨＤＧＤ−）（配列番号４）を有しており、このことは、この切断が組織においてＩＬ−１での刺激の間に生じたことを示している（図１３及び図４ｂ）。２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの断片は組織から同時に放出され（図２）、したがって、前述の４０ｋＤａの断片の形成と並行して切断されると考えられる。
【００３７】
先の実験において（５７）、軟骨をＩＬ−１で処理すると、ＭＭＰ−１３が活性な形態で現れ、９日目頃からフィブロモジュリンを切断することが示された。フィブロモジュリンにおける切断部位（−ＰＡＹ６３とＡ６４ＹＧ−との間）はＩＸ型コラーゲンにおいて見られた切断部位（−ＰＡＲ２５８ Ｉ２５９ＴＰ−）とは異なるが、本発明者らは、ＭＭＰ−１３での軟骨の消化により、ＩＬ−１で刺激した軟骨移植片の培地において本発明者らが見出した（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４の切断が生じ得るかどうかを試験することとした。
【００３８】
ウシ鼻軟骨移植片をＭＭＰ−１３で消化したところ、実際にこの酵素は（ＩＸ型）コラーゲンα１を切断した。ＮＣ４抗血清を用いるウェスタンブロットにより示される、培地における断片を含むＮＣ４の出現は、ＩＬ−１で誘導した切断により得られたものと非常に類似していた（図４ａ）。ＩＬ−１による刺激で以前に観察された、（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４から得られた２８ｋＤａ及び５０ｋＤａの２つの断片が、ＭＭＰ−１３消化でウシ軟骨から培地内に放出された。９日目、１２日目、及び１６日目にＩＬ−１処理した軟骨において見られた４０ｋＤａのバンドは、このブロットにおいては、より長い曝露時間にすると弱いバンドとして見ることができた（図４ａ、挿入図）。ＭＭＰ−１３消化したウシ軟骨の培地における２８ｋＤａの断片を、次に、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳによって（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ドメインであると同定した。それは、ＩＬ−１で刺激したウシ軟骨の培地において以前に見られたものと同じである、最もＣ末端のペプチド（ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８）（配列番号１）を含んでいた。
【００３９】
１６日目のＩＬ−１で刺激したウシ軟骨、及びＭＭＰ−１３消化したウシ軟骨の両方の培地において見られた５０ｋＤａの断片は、ＮＣ４及びＣＯＬ３ドメインに由来するペプチドを含むことが示された。本発明者らによる分析の前に、軟骨のＩＬ−１処理及びＭＭＰ−１３処理の両方で放出された５０ｋＤａの断片の予備分析により、両方のケースにおいて、ＣＯＬ３ドメインのＣ末端部分において生じた同一のＣ末端切断ペプチド（３つのヒドロキシル化＊残基を有する、Ｒ３８７ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＰ＊ＧＰＳＧ４００−ＣＯＯＨ（配列番号３））が明らかになった。コラゲナーゼであるＭＭＰ−１３が、ＩＬ−１処理した試料においてもこの切断を誘導した可能性がある。規定された１つ目の基質部位がコラゲナーゼのための基質部位に相当し、２つ目がゼラチナーゼなどの異なる酵素のためのものであるため、ＩＬ−１で刺激した軟骨における切断を実際に生じさせた酵素はＭＭＰ−１３であると考えられる。ＭＭＰ−１３は、これらの２つの活性を有することが知られている酵素に相当する。
【００４０】
組織成熟における段階としてのＩＸ型コラーゲンの除去は、初期の研究において論じられている（５８、５９）。後者は、ＮＣ４ドメインが鉱化の開始時に除去されたこと、並びに、鉱化が進むにつれ、ＩＩ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲンの両方がマトリックスから除去されたことを報告した。切断は同定されておらず、それが本発明において観察された切断のいずれかと同一であったか結論を出すのは不可能である。肥大軟骨細胞におけるＭＭＰ−１３の存在は、ｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションを用いてこれまでに観察されている（６０、６１）。本発明者らによる本研究において報告された結果と組み合わせると、軟骨内骨形成における段階として、ＩＸ型コラーゲンはＭＭＰ−１３により成長プレートの原線維から除去されることが妥当であると思われる。
【００４１】
示されたデータは、モデル系における、軟骨の重要な成分の分解を解明し、ＭＭＰ−１３を、ＩＸ型コラーゲンにおける特異的な切断を達成する能力を有するプロテアーゼであると特定するものである（図９、１０）。非三重らせんの部位及び三重らせん部分に対する部位が見出された。本発明において開示される新規な部位は、切断分子のみを認識する抗体を開発するために用いることができるものであり、分子マーカー技術による新規な診断手順の開発において用いることができた。
【００４２】
ヒトにおける研究の結果
ＭＭＰ−１３でのヒト関節軟骨の消化及び新規な切断部位の決定
ヒト関節軟骨は、ウシ鼻軟骨とは対照的に、ＭＭＰ−１３消化では消化の視認可能な兆候は示さなかった。それでも、消化培地を（ＮＣ４抗血清を用いて）ウェスタンブロットで分析したところ、反応性を示した（図５ａ）。バンドは３０ｋＤの見かけの質量を有しており、それにより、そのバンドは先に記載されたウシ断片から区別された。ウェスタンブロットにおいて染色されたバンドに対応するバンドを、クマシー染色したゲルから切り出し、Ａｓｐ−Ｎ又はＧｌｕ−Ｃで消化し、逆相ＬＣ ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ ＭＳで分析した。両方の消化物において、ＩＸ型コラーゲンα１のＮＣ４が同定され（図１１におけるＡｓｐ−Ｎの結果）、また、潜在的に新規な切断部位ＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ（配列番号６）ＮＨ２−ＴＴＤＥＲＧＰＰ−（配列番号７）に相当するペプチドが同定された。新規な切断部位は、２８ｋＤの断片において見られる、−ＥＴＣＮＥＬＰＡＲ２５８−ＣＯＯＨ（配列番号１）ＮＨ２−ＩＴＰＧＡＲＳＰ−（配列番号２）であるウシ切断部位の、５個のアミノ酸からなるＣ末端である。ウシ切断部位で切断された断片に適合する質量は、ヒト試料においては見られなかった。
【００４３】
潜在的な切断部位ペプチドの配列データを改善し、裏付けるために、ＥＳＩ−Ｑｔｏｆ質量分析計を用いた。本発明者らが有しているＱｔｏｆシステムはＩｏｎＴｒａｐよりも５倍感度が低く、したがって、３つのゲルバンドをプールし、重炭酸アンモニウム緩衝液中のエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで消化してアスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）の切断Ｎ末端を得た。
【００４４】
潜在的な切断部位ペプチドに先立つか又はそれと同時の任意のペプチド溶出に対するＭＳＭＳの実施で機器が占領されることを防ぐために、限定された数のペプチド質量に対して同定及びＭＳＭＳ配列決定の実施を行うように機器を設定した（図１２）。遅く溶出することが知られている２つの内部対照ＮＣ４ペプチドと、０個又は１個のミスしたＡｓｐ−Ｎ切断を有する２つの潜在的に新規な切断部位ペプチドと、ウシ軟骨における先に同定された切断部位ペプチドと同等のヒトペプチドとを選択した。対照ペプチド及び２つの潜在的に新規な切断部位ペプチドを、ＥＳＩ−ＩｏｎＴｒａｐ質量分析を用いて検出し、ここで本発明者らは、２つの後者のペプチドのＭＳＭＳデータを裏付けるためにＥＳＩ−Ｑｔｏｆ質量分析を用いることとする。Ｑｔｏｆ実験において、対照ペプチド及び新規なヒト切断部位から生じる２つのペプチドの両方を配列決定し、それらがＩＸ型配列に適合することを見出した（図５ｂに示す１つのペプチドのＭＳＭＳデータ）。ウシ切断部位ペプチドと同等のヒトペプチドはＱｔｏｆ分析においては（またＩｏｎＴｒａｐ分析においても）存在しなかった。
【００４５】
ネオエピトープペプチド抗血清（ＣＰＡ抗血清）
ＭＭＰ−１３で消化したヒト軟骨の培地のウェスタンブロットを、１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥでの消化物の分離及びネオエピトープペプチド抗血清を用いた同定により実施した。ＮＣ４に対する抗体を用いて観察されたバンドと同じ位置にあるバンドを同定した（図６）。変形性関節炎の患者から得た滑液は（関節リウマチの患者と対照的に）、アフィニティー精製したＣＰＡ抗血清を用いた阻害ＥＬＩＳＡにおいて強い阻害を示した（図８）。この実験はまた、ＳＤＳの添加が、ＣＰＡ抗血清が滑液エピトープを認識するために必須であることを示した。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
ウシ（ＩＸ型）コラーゲンα１のＮＣ４ペプチドの抗血清
免疫原としての可能性を示し、ＢＬＡＳＴ検索において見られた他の配列に対する相同性を示さない、ＩＸ型コラーゲンα１のＮＣ４ドメインのＮ末端部分の１５ｍｅｒのペプチド配列を、免疫化のために選択した。配列は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、イヌ、チンパンジー、及びアカゲザルにおいて同一であり、ＩＬ−１で刺激した軟骨の培地において存在した。Ｎ末端のシステインを結合のために付加し、免疫化のための配列であるＮＨ２−ＣＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱ６４−ＣＯＮＨ２（配列番号１４）を得た。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したペプチドを用いてウサギを免疫化した。ペプチド合成及び抗体の産生は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるカスタムサービスであった。ペプチド及び抗血清は、それぞれＮＣ４ペプチド及びＮＣ４抗血清と呼ばれる。
【００４７】
（実施例２）
ネオエピトープペプチド抗血清（ヒト）
放出された（ＩＸ型）α１断片のＣ末端部分に相当するペプチド（Ｃ）−ＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ（配列番号１３）を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させ、ウサギを免疫化するために用いた。アガロースに結合したペプチドを有するカラムを用いて、抗血清をアフィニティー精製した。ペプチド合成、ペプチドカラムの作製、及び抗体の産生は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるカスタムサービスであった。
【００４８】
（実施例３）
ウェスタンブロット（ウシ）−図２、４、及び５ａ
ＭＭＰ−１３で消化したウシ軟骨の培地の試料を１６％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動により分離し、次に、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した（３８）。ブロッキングは、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）における３％（ｗ／ｖ）低脂肪粉乳及び０．２％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０（商標）を用いて、４℃で一晩実施した。乳を除去したブロッキング溶液（上述）で膜をすすぎ、２％（ｗ／ｖ）乳、ＴＢＳ、及び０．２％Ｔｗｅｅｎ２０内に１：１０００で希釈したＮＣ４抗血清と共に、室温で１時間インキュベートした。すすいだ後、ニトロセルロース膜を、２％乳／ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０内に１：３００００で希釈したペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に室温で１時間インキュベートした。自作のＥＣＬ試薬（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を２０ｍｌ、ＤＭＳＯ内の２５０ｍＭのルミノールを４８μｌ、ＤＭＳＯ内の４０ｍＭのｐ−クマル酸を４８μｌ、及び１４μｌのＨ２Ｏ２）を用いて、ブロットを１分間活性化した。Ａｇｆａ ＣＲＯＮＥＸ５医療用Ｘ線フィルムを適当な時間にわたり膜に曝露し、Ａｇｆａ Ｃｕｒｉｘ６０で自動的に現像した。
【００４９】
（実施例４）
ウェスタンブロット（ヒト）
ＭＭＰ−１３で消化したヒト軟骨の培地のウェスタンブロッティングにおいて用いる、アフィニティー精製したネオエピトープ抗血清を、１：１００に希釈し、一方で、全ての他の条件は実施例４に記載したものである。
【００５０】
（実施例５）
阻害ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ｎｏ４４６６１２）を、ＰＢＳ内の０．１μｇ／ｍｌのＧＧＧＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３−ＣＯＯＨ（配列番号１５）ペプチドで、多湿の箱の中で一晩、室温で被覆した。ＰＢＳ内の２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを用いてさらなる結合を遮断した。ペプチド標準（０〜１０μｇ／ｍｌ）又は変形性関節炎の滑液（１：１０、１：４０、及び１：１６０）を、０．８％ＳＤＳ、０．５％オボアルブミン、及び０．１％ブタ血清に溶解し、多湿の箱の中で一晩、室温でｓｔｅｒｉｌｉｎプレート上でプレインキュベートした。各ペプチドの濃縮及び滑液の希釈を３回繰り返した。アフィニティー精製したネオエピトープ抗血清を、４％トリトン、１％ブタ血清内に１：１０００で希釈し、プレインキュベートしたペプチド標準及び滑液と混合し、その後、Ｎｕｎｃプレートに移した。二次抗体は、１％ブタ血清内において１：１０００の、アルカリホスファターゼ（Ｄａｋｏ−３０６）に結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリンであった。１ｍｇ／ｍｌのパラジニトロフェニルリン酸を基質として用いた（９．７％のジエタノールアミン、０．０１％ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．０２％ＮａＮ３）。４０５ｎｍでの吸光度の読み取りを、基質を添加した直後に行い、次に１時間のインキュベーションの後に行った。最初の読み取り（ゼロ読み取り）を２回目の読み取りから差し引き、同様に処理したこれらのウェルから得た結果を平均化し、ペプチドの濃縮又は試料の希釈に対してプロットした。
【００５１】
（実施例６）
骨ミネラル密度を用いたＮＣ４の存在／不在を比較する研究
橈骨遠位端骨折を有する５人の閉経後の女性を研究する。患者をギプス副子で４週間治療する。前腕骨の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を、骨折の２、４、６、及び８週間後に二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）で測定する。同じ時に血清試料を採取する。ＢＭＤの結果を、血清試料におけるＮＣ４の存在又は不在と比較する。ＮＣ４の検出を実施例５に従って行う。
【００５２】
骨折部位の骨ミネラル密度は、骨折の２、４、６、及び８週間後に対照四肢から得た値の２８％、４６％、８６％、１０３％であった。５つのケースの全てにおいて、骨折部位での骨ミネラル密度の変化は、ＮＣ４の存在／不在との相関を示した。２、４、６週目の場合ではＮＣ４は検出されるが、８週目の場合には不在である。ＮＣ４の存在／不在により、いつ骨折が完全に修復されるかを正確に決定することができる。結論として、ＮＣ４の量は、骨折の治癒のモニタリングにおける新規な技術として使用することができる。
【００５３】
したがって、前述のものは、本発明の原則のみを例示するに過ぎないとみなされる。さらに、当業者は多くの改変及び変更を容易に行い得るため、示され記載された厳密な構成及び操作に本発明を限定することは望ましくなく、したがって、配列の機能上の重要ではない変異を含む全ての適切な改変及び均等物が本発明の範囲内に再分類され得、小さな変異は本明細書において説明した特定の配列に同等なものであるとみなされる。
【００５４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液及び滑液におけるＩＸ型コラーゲンのα−１鎖の切断タンパク質断片のレベルを決定するステップを含む、結合組織を冒すヒトの障害を検出又はモニターする方法。
【請求項２】
障害が、関節疾患、変形性関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、腱断裂、骨粗しょう症、骨軟化症、骨折修復、及び動脈硬化からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＣ４が診断のためのマーカーとして用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
断片が、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮ末端のＮＣ４ドメインの、このＮＣ４ドメインのＣ末端部分に近い部位と、ＮＣ３ドメインに近いＣＯＬ３ドメインとでの切断により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
決定するステップが、ＩＸ型コラーゲンの切断により生じる切断ネオエピトープとの特異的な反応性を有する抗体の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
切断タンパク質断片のレベルが、ウェスタンブロット技術を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
切断タンパク質断片のレベルが、阻害ＥＬＩＳＡ分析を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
断片が、ＮＣ−４ドメインにおける、ヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖のＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３ＴＴＤＥＲＧＰＰ２７１（配列番号５）におけるグルタミン−２６３とスレオニン−２６４との間の新規な部位での切断により生じる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
断片が、ＣＯＬ３ドメインにおける、ヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖のＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００ＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号８）におけるグリシン−４００とスレオニン−４０１との間の新規な部位での切断により生じる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解活性を伴う、軟骨における病理学的プロセスによるＩＸ型コラーゲンの切断により生じる、ＮＣ４ドメインのＣ末端部分における切断ネオエピトープ。
【請求項１１】
Ｑ残基（グルタミン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１３）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１２】
末端のＴ残基（スレオニン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＴＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号７）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１３】
Ｇ残基（グリシン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ（配列番号９）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１４】
Ｔ残基（スレオニン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号１０）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１５】
ＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１３）、ＴＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号７）、ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ（配列番号９）、及びＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号１０）からなる群から選択される切断ネオエピトープとの特異的な反応性を有する抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体を含む、結合組織を冒すヒトの障害の検出又はモニタリングにおいて有用な診断キット。
【請求項１７】
Ｑ２６３が末端アミノ酸であるネオエピトープＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３（配列番号１３）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項１８】
Ｔ２６４が末端アミノ酸であるネオエピトープＴ２６４ＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号７）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項１９】
Ｇ４００が末端アミノ酸であるネオエピトープＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００（配列番号９）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項２０】
Ｔ４０１が末端アミノ酸であるネオエピトープＴ４０１ＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号１０）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項１】
血液及び滑液におけるＩＸ型コラーゲンのα−１鎖の切断タンパク質断片のレベルを決定するステップを含む、結合組織を冒すヒトの障害を検出又はモニターする方法。
【請求項２】
障害が、関節疾患、変形性関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、腱断裂、骨粗しょう症、骨軟化症、骨折修復、及び動脈硬化からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＣ４が診断のためのマーカーとして用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
断片が、ＩＸ型コラーゲンα１鎖のＮ末端のＮＣ４ドメインの、このＮＣ４ドメインのＣ末端部分に近い部位と、ＮＣ３ドメインに近いＣＯＬ３ドメインとでの切断により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
決定するステップが、ＩＸ型コラーゲンの切断により生じる切断ネオエピトープとの特異的な反応性を有する抗体の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
切断タンパク質断片のレベルが、ウェスタンブロット技術を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
切断タンパク質断片のレベルが、阻害ＥＬＩＳＡ分析を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
断片が、ＮＣ−４ドメインにおける、ヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖のＣＨＥＬＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３ＴＴＤＥＲＧＰＰ２７１（配列番号５）におけるグルタミン−２６３とスレオニン−２６４との間の新規な部位での切断により生じる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
断片が、ＣＯＬ３ドメインにおける、ヒトＩＸ型コラーゲンα１鎖のＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００ＴＩＧＦＨＤＧＤ４０８（配列番号８）におけるグリシン−４００とスレオニン−４０１との間の新規な部位での切断により生じる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解活性を伴う、軟骨における病理学的プロセスによるＩＸ型コラーゲンの切断により生じる、ＮＣ４ドメインのＣ末端部分における切断ネオエピトープ。
【請求項１１】
Ｑ残基（グルタミン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１３）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１２】
末端のＴ残基（スレオニン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＴＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号７）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１３】
Ｇ残基（グリシン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ（配列番号９）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１４】
Ｔ残基（スレオニン）が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、ＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号１０）を含む、請求項１０に記載の切断ネオエピトープ。
【請求項１５】
ＰＡＲＩＴＰＳＱ（配列番号１３）、ＴＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号７）、ＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ（配列番号９）、及びＴＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号１０）からなる群から選択される切断ネオエピトープとの特異的な反応性を有する抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体を含む、結合組織を冒すヒトの障害の検出又はモニタリングにおいて有用な診断キット。
【請求項１７】
Ｑ２６３が末端アミノ酸であるネオエピトープＰＡＲＩＴＰＳＱ２６３（配列番号１３）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項１８】
Ｔ２６４が末端アミノ酸であるネオエピトープＴ２６４ＴＤＥＲＧＰＰ（配列番号７）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項１９】
Ｇ４００が末端アミノ酸であるネオエピトープＲＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＲＧ４００（配列番号９）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【請求項２０】
Ｔ４０１が末端アミノ酸であるネオエピトープＴ４０１ＩＧＦＨＤＧＤ（配列番号１０）の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ）】
【図４ｂ）】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４ａ）】
【図４ｂ）】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１０−５２０４４９（Ｐ２０１０−５２０４４９Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１６５４（Ｐ２００９−５５１６５４）
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０８７２３
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０９２４５７５１）アナマル メディカル アクチボラゲット (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０８７２３
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０９２４５７５１）アナマル メディカル アクチボラゲット (2)
【Ｆターム（参考）】
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