新規なメチル化テアフラビン及びそれを含む組成物
【課題】１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有し、安定性や機能性に優れた新規なメチル化テアフラビンの提供。
【解決手段】１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有するメチル化テアフラビンであって、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする化合物。
【解決手段】１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有するメチル化テアフラビンであって、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有する新規なメチル化テアフラビンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の果実や葉等に主に含まれている成分の１つに、ポリフェノールがある。ポリフェノールとしては、例えば、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、イソフラボン類、アントシアニン類、フラバノール類、エラジタンニン類、フェニルプロパノイド類、アントシアニジン類、プロアントシアニジン類、カルコン類、オーロン類、フェニルエタノイド類等が挙げられる。より具体的には、没食子酸、エラグ酸、ヒドロキシチロソール、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキン−３−Ｏ−ガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、カテキン（Ｃ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、ガロカテキン（ＧＣ）、クロマニン、デルフィニジン、デルフィニジン３−Ｏ−グルコシド、プロシアニジンＢ２（ＰＢ２）、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸、カフェ酸フェネチルエステル、ストリクチニン、ケルセチン、イソクエルシトリン、ルチン、ミリセチン、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、エリオジクチオール等が挙げられる。これらのポリフェノールは、その構造に複数のフェノール性水酸基を持つことを特徴とし、抗酸化活性、血圧上昇抑制、血糖値上昇抑制、内脂肪蓄積抑制、動脈硬化抑制、抗炎症作用、抗がん性、アレルギー抑制、抗う蝕作用、消臭作用、抗菌活性等の様々な機能性が研究、報告されている。また、これらのポリフェノール以外にも、植物由来の成分に関して、様々な機能性が研究、報告されている。
【０００３】
これらのポリフェノールの中でも、水酸基にメチル基が修飾されたメチル化ポリフェノールは、メチル基で修飾されていないポリフェノールに比べて、吸収性、代謝安定性、機能性等に優れているという報告が多くなされている。例えば、茶品種“青心大ぱん”、“べにほまれ”、“べにふじ”、“べにふうき”等には、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート(ＥＧＣＧ３”Ｍｅ)やエピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣＧ４”Ｍｅ)が含まれているが、これらのメチル化カテキンをマウスへ経口投与した場合の、投与６０分後の血中メチル化カテキン濃度は、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）と比較して、遊離体で約９倍高い値を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、７−ヒドロキシフラボン、７，４’−ジヒドロキシフラボン、クリシン、アピゲニンとこれらのメチル化体を比較したところ、メチル化体のほうが、Ｃａｃｏ−２細胞を用いたヒト腸管吸収モデル試験において高い吸収性を示し、ヒト肝組織由来Ｓ９フラクションを用いた代謝安定性試験において良好な結果を示すことも報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。さらに、マウスマスト細胞を用いたヒスタミン遊離抑制試験に関しては、ＥＧＣＧ３”Ｍｅ、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、及びエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートは、ＥＧＣＧと比較して高い抗アレルギー作用を示し、かつメチル基の増加に伴ってその作用は強まる傾向を示したことも報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
紅茶ポリフェノールの一種であるテアフラビンにも、脂肪吸収抑制作用、抗酸化作用、血糖値上昇抑制作用や抗腫瘍作用等の様々な機能性が報告されている。これらの機能を生体内で効果的に発揮させるためには、十分量のテアフラビンを摂取することが重要だと考えられる。しかしながら、紅茶中のテアフラビン含量は少なく、かつ、酸化によって分解されやすい。このため、紅茶をそのまま飲食したとしても、テアフラビンを大量かつ安定的に摂取することは難しい。
【０００５】
カテキンと同様にメチル化することにより、テアフラビンの代謝安定性や機能性を改善し得ると考えられる。実際に、紅茶においても、メチル化ポリフェノールの一種であるメチル化テアフラビンが含まれていることが報告されているが、その含量は乾燥茶葉中に約０．０５％と通常のテアフラビンよりもさらに少ない（例えば、非特許文献３参照。）。
このため、メチル化テアフラビンを紅茶から大量に得ることは困難である。
【０００６】
メチル化テアフラビンを人為的に得る方法としては、エピガロカテキン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート等のメチル化カテキン、エピカテキン、及びエピカテキンガレートを原料として、酸化酵素により重合させる方法がある（例えば、非特許文献３参照。）。
しかしながら、天然に希少なメチル化カテキンを原料として使用するこのような方法では、そもそも原料を得ること自体が難しいことに加えて、合成されるメチル化テアフラビンは、原料となるメチル化カテキンの種類に依存する。このため、現在までに、テアフラビン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、テアフラビン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート，３’−Ｏ−ガレートしか得られていない。また、非特許文献３においては、メチル化テアフラビンの機能性は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１８９６２８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】サノ（Sano）、外３名、フレグランス・ジャーナル（FRAGRANCE JOURNAL）、２０００年、４号、第４６〜５２ページ。
【非特許文献２】ウェン（Wen）、外１名、ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metabolism and Disposition）、２００６年、第３４巻第１０号、第１７８６〜１７９２ページ。
【非特許文献３】ニシムラ（Nishimura）、外５名、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー(Journal of Agricultural and Food Chemistry) ２００７年、第５５巻、第７２５２〜７２５７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
テアフラビン等のポリフェノール類は、非常に多くの機能を有しているが、これらの機能は、ポリフェノールの種類によって異なる場合がある。同様に、メチル化ポリフェノールにおいても、ポリフェノール中のいずれの水酸基をメチル化するかによって、その作用効果や活性強度が異なる可能性が高い。このため、様々なテアフラビン類をメチル化することにより、より代謝安定性や機能性に優れたメチル化テアフラビンを得ることができると期待される。
【００１０】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有し、安定性や機能性に優れた新規なメチル化テアフラビンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、テアフラビンをはじめとするポリフェノールの水酸基を効率よくメチル化することができる新規なメチルトランスフェラーゼを得、当該酵素を用いてテアフラビンを基質とした酵素反応法を行なうことにより、新規なメチル化テアフラビンを合成することにより、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１） １又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有するメチル化テアフラビンであって、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする化合物、
【化１】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【化２】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【化３】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【００１３】
（２） 下記式（Ｉ）−１、（ＩＩ）−１〜４、及び（ＩＩＩ）−１〜３からなる群より選択される１の式で表されることを特徴とする、前記（１）に記載の化合物、
【化４】
【化５】
【化６】
【００１４】
（３） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物、
（４） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする脂肪蓄積抑制剤、（５） 前記化合物が前記式（Ｉ）−１で表される化合物であることを特徴とする前記（４）記載の脂肪蓄積抑制剤、
（６） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする抗酸化剤、
（７） 前記化合物が、前記式（ＩＩ）−１、（ＩＩ）−３、（ＩＩＩ）−１、（ＩＩＩ）−２、及び（ＩＩＩ）−３で表される化合物から選択される１種以上であることを特徴とする前記（６）記載の抗酸化剤、
（８） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする飲食品、
（９） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬品又は医薬部外品、
（１０） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする化粧品、
（１１） 下記式（Ｉ）−０で表される化合物、下記式（ＩＩ）−０で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩ）−０で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を基質として、メチルトランスフェラーゼ酵素を反応させることにより、前記一般式（Ｉ）で表される化合物、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物、及び前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を合成することを特徴とする、メチル化テアフラビンの製造方法、
【化７】
（１２） 前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の酵素であることを特徴とする前記（１１）記載のメチル化テアフラビンの製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のメチル化テアフラビンは、非メチル化体であるテアフラビンと同様の生理機能を有する上に、非常に良好なｐＨ安定性及び代謝安定性を有する。このため、本発明のメチル化テアフラビンを飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な商品へ応用することにより、非メチル化体を使用するよりも、機能性や経済性に優れた製品の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示した図である。
【図２】図２（Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、上記２種類の担子菌の遺伝子と、相同性検察の結果相同性が高かった上位４遺伝子とのアミノ酸配列を比較した結果である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）中の１〜４に示す領域から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列であると推定された配列を表す図である。
【図３】参考例１において、エノキタケ菌糸培養物から分画されたメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する活性画分の二次元電気泳動像である。
【図４】参考例２において、ＩＰＴＧ処理前の大腸菌のライセート（レーン１）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセート（レーン２）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートからヒスチジンタグを用いて得られた精製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。
【図５】参考例５において、各反応時間後に分取した酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。図５（Ａ）が天然型酵素の結果であり、図５（Ｂ）が組換え酵素の結果である。
【図６】参考例６において、各ｐＨの酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図７】参考例７において、各温度の酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図８】実施例２において、メチル化テアフラビン含有紅茶ポリフェノールの製造過程におけるテアフラビンとメチル化テアフラビンの組成を経時的に測定した結果を示した図である。
【図９】実施例３において、各種テアフラビン及びメチル化テアフラビンの残存率を反応開始２時間後に測定した結果を示した図である。図９（Ａ）がｐＨ５．０の結果であり、図９（Ｂ）がｐＨ７．５の結果である。
【図１０】実施例４において、各種テアフラビン及びメチル化テアフラビンの残存率を反応開始６０分後に測定した結果を示した図である。
【図１１】実施例５において、各処理を施した細胞群の脂肪蓄積量の測定結果を示した図である。図１１（Ａ）は各被検素材を１μＭとなるように培地中に添加した場合の結果であり、図１１（Ｂ）は３μＭとなるように培地中に添加した場合の結果である。
【図１２】実施例６において、ＨｅｐＧ２細胞生存率の測定結果を示した図である。図１２（Ａ）がＴＦ３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果であり、図１２（Ｂ）がＴＦ３，３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明及び本願明細書において使用する各化合物の略称を以下に示す。
ＴＦ：テアフラビン
ＴＦ３Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート
３ＭｅＴＦ３Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート
３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート
ＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−ガレート
３ＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート
４ＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート
３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート３，４ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレートＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３，３’ −ジ−Ｏ−ガレート
３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート,３’−Ｏ−(３−Ｏ−メチル)ガレート
４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート,３’−Ｏ−(４−Ｏ−メチル)ガレート
３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート,３’−Ｏ−(３，５−Ｏ−ジメチル)ガレート
Ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ：紅茶抽出物、紅茶エキス
【００１８】
本発明及び本願明細書において、テアフラビンとは、下記式（Ｉ）−０で表される化合物（ＴＦ３Ｇ）、下記式（ＩＩ）−０で表される化合物（ＴＦ３’Ｇ）、又は下記式（ＩＩＩ）−０で表される化合物（ＴＦ３，３’Ｇ）を示す。なお、これらの式で表される化合物は複数の異性体を有しているが、これらの異性体も、テアフラビンに含まれる。
また、本発明及び本願明細書において、メチル化テアフラビンとは、テアフラビンのガロイル基中の少なくとも１の水酸基がメチル化されている化合物を意味する。
【００１９】
【化８】
【００２０】
＜新規メチルトランスフェラーゼ＞
本発明者らは、新規なメチル化テアフラビンを合成するために、後記参考例１等に示すように、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の新規なメチルトランスフェラーゼを単離・同定した。
得られたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）及び対応するアミノ酸配列（配列番号２）を図１に示す。配列番号１で表される塩基配列の４５位〜７３４位がコーディング領域である。
【００２１】
なお、配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、公開されているＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースを用いてホモロジー検索を行った結果、最も相同性の高い遺伝子はオオキツネタケ由来遺伝子Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２（アクセッション番号：ＸＭ＿００１８７８８０３）であり、塩基配列で６３．６％、アミノ酸配列で６１．６％程度の相同性であった。
【００２２】
また、全ゲノム配列が判明している担子菌類であるモデルキノコのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｈｃｈｒ１／Ｐｈｃｈｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を用いて、同様にホモロジー検索を行った結果、最も相同性の高い遺伝子はＯ-メチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：１２７１１５）であり、塩基配列で６３．９％、アミノ酸配列で５６．８％程度の相同性であった。
【００２３】
図２（Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、上記２種類の担子菌の遺伝子と、相同性検察の結果相同性が高かった上位４遺伝子とのアミノ酸配列を比較した結果である。図２（Ａ）中、「Ｆ．ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ」は配列番号２で表されるアミノ酸配列を表す。また、「Ｌ．ｂｉｃｏｌｏｒ Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２」はオオキツネタケ由来遺伝子Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２、「Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ」はモデルキノコ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、「Ｂ．ｉｎｄｅｉｃａ ｓｕｂｓｐ．」はＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿００１８３２７９７）、「Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ」はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿７７７３１０）、「Ｂ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ」はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＭＳＭＢ４３由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＺＰ＿０２４６６６０９）、及び「Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ」はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９４由来遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿００１４３７７８５）の推定アミノ酸配列をそれぞれ表す。
【００２４】
本発明者らは、このアラインメントから、図２（Ａ）中、１〜４に示す領域が、全７種類の遺伝子において保存性の高い領域であることを見出した。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列中、領域１は７０〜８８番目の領域であり、領域２は１３９〜１４８番目の領域であり、領域３は１７１〜１７５番目の領域であり、領域４は２１５〜２２３番目の領域である。さらに本発明者らは、これらの４領域のアミノ酸配列から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列を推定した。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）中の１〜４に示す領域から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列であると推定された配列を表す。なお、図２（Ｂ）中、「ｘ」はいずれのアミノ酸残基であってもよいことを意味し、「（／）」は、括弧内のいずれかのアミノ酸残基であることを意味する。
【００２５】
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、ＮＣＢＩデータベースを用いて植物由来のメチルトランスフェラーゼ酵素とのホモロジー検索を行った結果、ダイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＡＹ２７９００４）と、塩基配列で５３．９％、アミノ酸配列で３０．４％の相同性であった。同様に、イネ（Ｏｌｙｚａｓａｔｉｖａ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＡＹ２７９００４）と５０．７％（塩基配列）及び３０．０％（アミノ酸配列）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＭＮ＿１１６０６５）５２．３％（塩基配列）及び３０．８％（アミノ酸配列）程度の相同性であった。さらに、特許文献４に記載の、茶から単離されたＥＧＣＧをメチル化可能なメチルトランスフェラーゼ酵素と比較した結果、塩基配列で５３．９％、アミノ酸配列では３０．４％程度の相同性であった。
【００２６】
本発明者らは、テアフラビンを基質とし、同定したエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼによる酵素反応によって、メチル化テアフラビンを得た。この結果、公知のメチル化テアフラビンである３ＭｅＴＦ３Ｇ以外にも、多くの新規なメチル化テアフラビンを得た。
【００２７】
すなわち、本発明のメチル化テアフラビンは、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする。
【００２８】
【化９】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【００２９】
【化１０】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【００３０】
【化１１】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【００３１】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。
一般式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。
一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。
なお、これらの一般式で表される化合物は複数の異性体を有しているが、これらの一般式で表される化合物である限り、いずれの異性体も、本発明のメチル化テアフラビンに含まれる。
【００３２】
本発明のメチル化テアフラビンとしては、特に、式（Ｉ）−１で表される化合物（３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇ）、式（ＩＩ）−１で表される化合物（３ＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩ）−２で表される化合物（４ＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩ）−３で表される化合物（３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩ）−４で表される化合物（３，４ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩＩ）−１で表される化合物（３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ）、式（ＩＩＩ）−２で表される化合物（４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ）、及び式（ＩＩＩ）−３で表される化合物（３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇ）であることが好ましい。
【００３３】
【化１２】
【００３４】
【化１３】
【００３５】
【化１４】
【００３６】
本発明のメチル化テアフラビンは、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼを用いた酵素反応により初めて合成されたものである。紅茶にはテアフラビンが含まれており、かつ生茶葉由来のメチルトランスフェラーゼも公知である（例えば、特開２００７−３０６８０６号公報）。にもかかわらず、今までこれらのメチル化テアフラビンが得られていなかった理由は明らかではないが、生茶葉由来メチルトランスフェラーゼがカテキン類に対する特異性が高く、テアフラビン類に対する特異性が十分ではない可能性や、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの酵素活性が、生茶葉由来メチルトランスフェラーゼ等の公知のメチルトランスフェラーゼよりも高い可能性がある。
【００３７】
本発明のメチル化テアフラビンは、テアフラビンをメチルトランスフェラーゼによりメチル化することによって製造することができる。より具体的には、例えば、１種類又は２種類以上のメチルトランスフェラーゼを、ｐＨ５〜１２、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ６．５〜８．５の緩衝液に懸濁し、さらにテアフラビン含有物とメチル基の供与体とを加えて、０〜８０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは３０〜４２℃で反応させることにより、酵素反応液中にメチル化体を得ることができる。なお、テアフラビン含有物としては、紅茶、紅茶抽出物、紅茶ポリフェノール、テアフラビン標準品等を用いることができる。また、メチル基の供与体としては、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ (ＳＡＭ)等の、一般的にフェノール性水酸基のメチル化の際に用いられる物質の中から、適宜選択して用いることができる。
【００３８】
本発明のメチル化テアフラビンを製造するために用いられるメチルトランスフェラーゼとしては、テアフラビンのガロイル基中の水酸基をメチル化できる酵素であれば特に限定されるものではなく、フェノール性水酸基をメチル化することが可能な一般的なメチルトランスフェラーゼの中から適宜選択して用いることができる。このようなメチルトランスフェラーゼとして、例えば、微生物由来や植物体由来のメチルトランスフェラーゼ、ラット、豚、牛肝臓由来のカテコールメチルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００３９】
本発明のメチル化テアフラビンを製造するためには、担子菌類の子実体又は菌糸体から得たメチルトランスフェラーゼを利用することが好ましく、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ又は当該酵素の他の担子菌類由来のホモログであることがより好ましく、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼであることが特に好ましい。
【００４０】
エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの他の担子菌類由来のホモログは、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは５５％以上、さらに好ましくは６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００４１】
なお、塩基配列とアミノ酸配列の相同性検索をする場合には、一般的に、最初にＧＡＰを考慮せずホモロジーの核となる部分を探し、そこからアライメント処理を行う方法（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｓｅａｒｃｈ）と、置き換えや欠損を考慮しながら、塩基（アミノ酸）配列間で一致する塩基（アミノ酸残基）対が最大になるように並べ替える方法（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇ）とがある。本発明及び本願明細書における「相同性」の値は、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇを用いて解析し、得られる値を示す。Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇによる相同性検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１．０（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）等の汎用されている解析ソフトウェアを用いて行うことができる。
【００４２】
メチル化テアフラビンの製造に用いられるメチルトランスフェラーゼは、天然の酵素であってもよく、公知の遺伝子組換え技術等を用いて製造された組換え酵素であってもよい。組換え酵素としては、天然の酵素と同一のアミノ酸配列を有するものであってもよく、天然の酵素に対して１以上のアミノ酸を置換・欠失・付加したアミノ酸配列からなり、かつメチルトランスフェラーゼ酵素活性を保持している改変体であってもよい。また、これらのメチルトランスフェラーゼとしては、市販のものを用いてもよい。
【００４３】
天然のメチルトランスフェラーゼは、当該酵素を含む生物体から抽出し、精製することにより、得ることができる。生物体からの精製方法は、特に限定されるものではなく、一般的に行われる公知の精製方法の中から、適宜選択して行うことができる。また、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が発揮される状態まで精製すればよく、精製度は特に限定されず、粗精製であってもよい。
【００４４】
例えば、担子菌類の子実体又は菌糸体由来メチルトランスフェラーゼの場合、具体的には、本発明の遺伝子を含む担子菌類の子実体又は菌糸体を、適当な緩衝液中で超音波処理等により破砕した後、回収された上清を粗酵素とすることができる。その他、担子菌類の子実体又は菌糸体を、適当な緩衝液中でホモジナイズした後、上清を回収してもよい。粗酵素を得るための緩衝液としては、例えば、ｐＨ６．５〜８．５のトリス緩衝液やリン酸緩衝液等を用いることができる。
【００４５】
また、酵素を抽出する担子菌類は、採取直後のものであってもよく、市販等されているものであってもよく、培養物であってもよい。なお、担子菌類の菌糸体の培養は、常法により行うことができる。
【００４６】
このようにして得られた粗酵素は、そのまま酵素反応に用いることができる。さらには、遠心分離、限外ろ過膜、塩析、各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより、粗酵素から精製物を得ることもできる。
【００４７】
メチルトランスフェラーゼの組換え酵素は、公知のいずれの手法で製造してもよい。具体的には、メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターを、微生物や培養細胞等の適当な生物体（宿主）に導入し、当該組換え発現ベクターを含む形質転換体を製造する。このようにして得られた形質転換体をそれぞれの生物体の最適な条件で培養することにより、当該形質転換体内にメチルトランスフェラーゼの組換え酵素が生成される。そこで、形質転換体の培養物から抽出し、精製することにより、メチルトランスフェラーゼの組換え酵素を得ることができる。
【００４８】
酵素反応により得られたメチル化テアフラビンは、酵素反応液から、メチル化テアフラビンを抽出することが可能な溶媒等を用いることにより抽出することができる。なお、酵素反応液は、濃縮した後に抽出に用いてもよい。その他、酵素反応液を、合成吸着剤を充填したカラムに供して、メチル化テアフラビンを当該合成吸着剤に吸着させ、さらに洗浄した後、適当な溶媒を用いて溶出させることによっても、メチル化テアフラビンを得ることが可能である。さらにＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製することにより、純度の高い新規なメチル化テアフラビンを製造することも可能である。
【００４９】
本発明のメチル化テアフラビンは、飲食品、医薬品、医薬用部外品及び化粧品を始めとする様々な製品に用いることができる。本発明のメチル化テアフラビンは、これらの製品にそのまま原料として用いてもよく、その他の成分と予め混合することにより得られた組成物を原料として用いてもよい。
【００５０】
本発明のメチル化テアフラビンは、非メチル化体よりも優れたｐＨ安定性及び代謝安定性を有している。このため、本発明のメチル化テアフラビンを各種製品に用いた場合には、非メチル化体を用いる場合と比較して、より少ない添加量で、同等の機能を発揮させることができる。
【００５１】
なお、本発明及び本願明細書において、ｐＨ安定性とは、ｐＨが中性付近の溶液中で保存した場合の分解の受け難さ（安定性）をいう。また、代謝安定性とは、生体内若しくはそれに類する環境下で保存した場合の分解の受け難さをいう。
【００５２】
また、本発明のメチル化テアフラビンは、脂肪蓄積抑制作用や抗酸化作用を有する。このため、本発明のメチル化テアフラビン又はこれを含む組成物を有効成分とすることにより、脂肪蓄積抑制剤や抗酸化剤を製造することができる。なお、脂肪蓄積抑制剤や抗酸化剤に含まれるメチル化テアフラビンは、１種類であってもよく、２種類以上を組み合わせて含ませてもよい。
【００５３】
脂肪蓄積抑制剤としては、特に式（Ｉ）−１で表される３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを有効成分として含むことが好ましい。３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇは、非メチル化体であるＴＦ３Ｇに比べて非常に良好な脂肪蓄積抑制作用を有するためである。脂肪蓄積抑制剤に含有させるメチル化テアフラビンの量は、脂肪蓄積抑制能が発揮される濃度であれば特に限定されるものではなく、メチル化テアフラビンの種類、所望する脂肪蓄積抑制の強度等を考慮して適宜設定することができる。例えば、３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを用いた場合には、０．５〜１０μＭ、好ましくは０．５〜５μＭ、より好ましくは１〜３μＭとすることができる。
【００５４】
抗酸化剤としては、特に式（ＩＩ）−１で表される３ＭｅＴＦ３’Ｇ、式（ＩＩ）−３で表される３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ、式（ＩＩＩ）−１で表される３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、式（ＩＩＩ）−２で表される４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、又は式（ＩＩＩ）−３で表される３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇの少なくとも１種類を有効成分として含むことが好ましい。これらのメチル化テアフラビンは、対応する非メチル化体に比べて非常に良好な抗酸化作用を有するためである。抗酸化剤に含有させるメチル化テアフラビンの量は、抗酸化能が発揮される濃度であれば特に限定されるものではなく、メチル化テアフラビンの種類、所望する抗酸化能の強度等を考慮して適宜設定することができる。例えば、３ＭｅＴＦ３’Ｇ、３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ、３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、又は３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇを用いた場合には、０．１μＭ以上、好ましくは０．１〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜２０μＭ、さらに好ましくは０．２〜２μＭとすることができる。
【００５５】
飲食品、医薬品、医薬用部外品及び化粧品に用いる場合には、エノキタケ等の食用担子菌類から回収されたメチルトランスフェラーゼ酵素を用いて製造されたメチル化テアフラビンを用いることが好ましい。エノキタケ等の食用担子菌類から回収されたメチルトランスフェラーゼ酵素は安全性が高いため、飲食品や医薬品、化粧品等の十分な安全性が要求される製品の工業生産に適している。また、担子菌類は簡便に大量培養（栽培）することができる。
【００５６】
当該メチル化テアフラビン又はその組成物が原料として添加される飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ギョーザの皮、シュウマイの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠果、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水酸・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂加工食品；ソース、タレ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品等を挙げることができる。
【００５７】
本発明のメチル化テアフラビン又はその組成物が原料として添加される医薬品及び医薬部外品の剤型としては、錠剤、液剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等が挙げられる。
また、化粧品としては、洗顔クリーム、化粧水、パック、美容液等の基礎化粧品類；ファンデーション、口紅、アイカラー等のメイクアップ化粧品類；ネイルエナメル、石鹸、入浴剤、サンスクリーン剤、デオドラントスプレー等のボディ化粧品類；シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアームース等の頭髪用化粧品類；育毛剤、養毛剤、ヘアトニック等の頭髪用化粧品類；香水、オーデコロン等の芳香用化粧品類を挙げることが出来る。
【００５８】
これらを製造するにあたり、本発明のメチル化テアフラビン又はその組成物は、通常用いられている補助的な原料や添加物と共に添加することができる。このような原料及び添加物としては、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存料等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
次に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例に限定されるものではない。
【００６０】
［参考例１］
エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離・同定を行った。
＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞
食用として市販されている日本産のシイタケ、シメジ、マイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、ナラタケ、タモギタケ、エリンギ、アワビタケをスクリーニングに用いた。
これらの子実体を用いて柄の部分をカットし、０．５％次亜塩素酸に浸した後、滅菌水で洗浄した。柄の内部から５ｍｍ程度を切り出し、Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ培地上で、２５℃にて培養し、菌糸体を単離した。得られた菌糸体を、菌糸体培養用液体培地（０．０２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．０１％ ｐｅｐｔｏｎｅ、０．００２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．００２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．００１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に接種し、２８℃で旋回培養した。
【００６１】
得られた菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、粗酵素溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加えて超音波破砕した後、遠心分離して上清を回収した。この上清を粗酵素液として酵素活性測定に用いた。
酵素活性測定は、基質としてＥＧＣＧを用い、そのメチル化体の生成量を指標とした。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、及び５０％ 粗酵素液とし、全量３ｍｌを３７℃、１６時間反応させた。
反応後、酵素反応液３ｍｌに、１Ｎ ＨＣｌ ７０μl及び酢酸エチル５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離して有機層を回収した。有機層を窒素で乾固した後、１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸含有３０％メタノール水溶液に溶解し、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００６２】
カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ１８−５（４．６×１５０ｍｍ）及びＣ１８−５（４．６×１０ｍｍ）（和光純薬社製）
移動相Ａ：蒸留水、アセトニトリル、リン酸を４００：１０：１(ｖ／ｖ)で混合した溶液移動相Ｂ：移動相Ａとメタノールを２：１(ｖ／ｖ)で混合した溶液
グラジエント条件：２０％Ｂ液(２分間)→８０％Ｂ液(２５分間)→８０％Ｂ液(１０分間)、直線濃度勾配
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００６３】
その結果、エノキタケ培養菌糸体から抽出した粗酵素を用いた場合に、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成が確認された。なお、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートに関しては、それらのピークを分取し、ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲを用いて構造を確認した。また、粗酵素液を煮沸した後に酵素反応液に添加した場合や、酵素反応液にＥＧＣＧやＳＡＭを添加しなかった場合には、これらのメチル化体の生成は認められなかった。
以上の結果から、エノキタケ培養菌糸体から抽出した粗酵素がメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することが確認された。
【００６４】
＜各種エノキタケ酵素活性の確認＞
エノキタケの採取地の違い等によるメチルトランスフェラーゼ酵素活性の有無を確認した。エノキタケの菌糸は、農業生物資源ジーンバンクより購入したものを使用し、Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ培地上で２５℃にて培養した。菌糸体の液体培養及び酵素活性測定は、上記＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様にして行った。試験には、ＭＡＦＦ番号４３０２０４、４３０２０５、４３０２０６、４３０２０７、４３０２０９、４３５２１０、４３０２１２、４３０２１４、４３０２２４、４３５０８５、４３０２１１、４３０２１３、４３５１２１、４４０１１０、４４０１１１、及び４４０１１８を用いた。その結果、それぞれの菌糸によって酵素活性の強弱はあるものの、全ての菌糸において、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を確認した。
【００６５】
＜エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの同定＞
上記と同様にしてエノキタケ菌糸体を液体培養し、得られた菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥物約１２ｇを乳鉢で破砕した後、粗酵素溶解液６００ｍｌに懸濁した。この懸濁物を超音波破砕した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）し、回収した上清を再度遠心分離（３０，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４℃）して上清を回収した。この上清に、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して上清を回収した。さらに、この回収した上清に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を、粗酵素溶解液４０ｍｌに溶解した後、ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルは、トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ ＤＥＡＥ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が確認されたフラクションを、活性画分として分取した。なお、メチルトランスフェラーゼ酵素活性の確認は、＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様にして行った。
【００６６】
得られた活性画分を、限外ろ過カラムで脱塩、濃縮した後、上記トリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、活性画分を分取した。得られた活性画分を、限外ろ過カラムにて脱塩、濃縮し、再度同じ陰イオン交換カラムに吸着させ、分取画分を前条件より詳細にして活性画分を分取し、同様に限外ろ過カラムにて脱塩、濃縮を行った。
【００６７】
得られた濃縮画分を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて分画した。分取した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、得られたタンパク質染色像と、各画分のメチルトランスフェラーゼ酵素活性とを比較したところ、酵素活性と相関したバンドが、約２４〜２５ｋＤａの位置に確認された。酵素活性が確認された画分を、さらに、上記トリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ ＢＩＯＡＳＳＩＳＴ Ｑ、東ソー社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、活性画分を分取した。活性画分を、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた結果、約２４〜２５ｋＤａの位置に再度特異的なバンドを確認した。この酵素タンパク質の内部配列を明らかにするために上記陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、バンドをゲルから回収した。
【００６８】
回収したバンドは、常法に従ってゲル内トリプシン消化処理を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてタンパク質の内部配列を解析した。さらに、同じ活性画分を二次元電気泳動で電気泳動し（一次元目：ｐＨ３〜１０の等電点分離、二次元目：４〜２０％グラジエントのポリアクリルアミドゲル）、分子量約２４〜２５ｋＤａ、ｐＨ５付近のスポットをゲルから回収した。図３は、二次元電気泳動像である。図中、丸で囲んだスポットを、目的の酵素タンパク質として回収した。
【００６９】
この回収したスポットに対して常法に従ってゲル内トリプシン消化処理を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、スポットに存在しているタンパク質の内部配列の確認を行った。その結果、内部配列ＲＶＬＥＶＧＴＬＧＧＹＳＴＴＷＬＡＲＡ（配列番号３）及びＴＧＧＩＩＩＶＤＮＶＶＲ（配列番号４）を得た。このアミノ酸配列をもとに、ＮＣＢＩのデータベースによるホモロジー検索を行った結果、既知のＯ−メチルトランスフェラーゼの内部配列と高い相同性を有していた。
【００７０】
＜エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離・同定＞
上記内部配列の配列情報に基づいてディジェネレートプライマーを設計し、エノキタケから回収したｔｏｔａｌ−ＲＮＡから、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を単離・同定した。
具体的には、まず、エノキタケ培養菌糸体約１ｇを、乳鉢を用いて液体窒素下で破砕したものから、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社製）を用いてｔｏｔａｌ−ＲＮＡを回収した。得られたｔｏｔａｌ−ＲＮＡ約４μｇから、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて、５５℃、５０分間反応させることによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、上記内部配列の配列情報に基づいて設計されたディジェネレートプライマー（ＦＶＯＭＴ−Ｆ及びＦＶＯＭＴ−Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離を行った。設計されたディジェネレートプライマーの塩基配列及びＰＣＲ条件を下記に記す。なお、塩基配列中、Ｓはグアニン又はシトシンを、Ｍはアデニン又はシトシンを、Ｙはチミン又はシトシンを、Ｄはアデニン、グアニン、又はチミンを、Ｋはグアニン又はチミンを、Ｖはアデニン、グアニン、又はシトシンを、Ｒはグアニン又はアデニンを、それぞれ示す。
【００７１】
ＦＶＯＭＴ−Ｆ：ＧＡＧＧＴＳＧＧＭＡＣＹＹＴＤＧＧＭＧＧＳＴＡ
ＦＶＯＭＴ−Ｒ：ＧＣＫＳＡＣＶＡＣＲＴＴＲＴＣＭＡＣ
ＰＣＲ条件：９４℃，５ｍｉｎ→（９４℃，１ｍｉｎ→５５℃，１ｍｉｎ→７２℃，１ｍｉｎ）×４０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃，７ｍｉｎ
【００７２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果、約４００ｂｐの増幅バンドが確認された。アガロースゲルから当該バンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を回収し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター(プロメガ社製)へクローニングした後、大腸菌ＪＭ−１０９株（タカラ社製）へ形質転換した。得られた形質転換体を、ＬＢ培地にて３７℃で終夜振とう培養し、得られた培養物からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドのインサートの塩基配列を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００−ＡＶＡＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）により確認した。
【００７３】
確認された遺伝子の部分塩基配列をもとに、特異的プライマー（ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２、ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１、ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２）を設計し、５’側と３’側の全長を取得するためにＲＡＣＥ−ＰＣＲ法を行った。設計した特異的プライマーの塩基配列を下記に示す。
【００７４】
ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１：ＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡ
ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２：ＴＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴ
ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１：ＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡ
ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２：ＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴ
【００７５】
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、まず、単離したｔｏｔａｌ−ＲＮＡ２．５μｇから、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１プライマーを用い、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて、５５℃、５０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。次いで、得られたｃＤＮＡから、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（インビトロジェン社製）を用い、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１プライマー及びＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２プライマーを用いて５’側の単離を行い、塩基配列を確認した。
同様に、３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（インビトロジェン社製）を用いて、得られたｃＤＮＡからＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１プライマー及びＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２プライマーを用いて３’側の単離を行い、塩基配列を確認した。
【００７６】
確認された５’末端及び３’末端の塩基配列に基づき、下記に示すＦＶＯＭＴ−５’ＮｄｅＩプライマー及びＦＶＯＭＴ−３’ＢａｍＨＩプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅バンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換後、インサートの塩基配列を確認した。その結果、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の全遺伝子を単離するにいたった。同定されたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている。
【００７７】
ＦＶＯＭＴ−５’ＮｄｅＩ：ＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＴ
ＦＶＯＭＴ−３’ＢａｍＨＩ：ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣ
【００７８】
［参考例２］
＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の製造＞
参考例１で単離されたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターを大腸菌に導入して、大腸菌内で発現させたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素を回収した。
具体的には、まず、参考例１で作製したエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子含有ｐＧＥＭ−Ｔベクターから、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、アガロース電気泳動により、インサートを回収した。このインサートを、ｐＥＴ２８ａ(＋)ベクター（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトへクローニングすることにより、組換え発現ベクターを作製した。この組換え発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)株（ストラタジーン社製）へ導入することにより、当該組換え発現ベクターを含む形質転換体を得た。
【００７９】
得られた形質転換体をＬＢ培地にて３７℃で終夜振とう培養した後、その一部を再度新しいＬＢ培地へ添加して培養した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．６付近となるように培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに２８℃で振とう培養して、ヒスチジンタグ付酵素タンパク質の発現誘導を行った。発現誘導した大腸菌を遠心分離し、沈殿物を上記トリス緩衝液に懸濁した。この大腸菌懸濁液を超音波破砕し、再度遠心分離した。得られた上清（ライセート）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した結果、ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌を同様に処理して電気泳動した場合と比較して、約２９ｋＤａ付近に、ＩＰＴＧ処理により発現が誘導されたタンパク質のバンドを確認した。
【００８０】
図４は、ＩＰＴＧ処理前の大腸菌のライセート（レーン１）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセート（レーン２）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートからヒスチジンタグを用いて得られた精製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。図中、「Ｍ」は分子量マーカーを流したレーンである。図中の矢印の位置のバンド（約２９ｋＤａ）を画像解析し、タンパク質量を数値化して比較した。画像解析には、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドビシステムズ社製）及びＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）ソフトウェアを使用した。その結果、この約２９ｋＤａのタンパク質量は、ＩＰＴＧ処理前を０％とした場合、ＩＰＴＧ処理後で８．４％、処理後の精製物で２５．１％であり、当該タンパク質が、ＩＰＴＧ処理により発現が誘導されたヒスチジンタグを有するタンパク質であることが確認された。
【００８１】
ｐＥＴ２８ａ(＋)ベクターのＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトへクローニングした場合、約５ｋＤａのベクター由来発現タンパク質（ヒスチジンタグを含む）が付加される。また、配列番号２のアミノ酸配列から算出された本酵素タンパク質の理論分子量は、２４．７ｋＤａである。つまり、図４の矢印で示した約２９ｋＤａのタンパク質は、組換え発現ベクターにより導入したアミノ酸配列から得られる推定分子量と一致し、ヒスチジンタグ付きエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素であることが分かった。
【００８２】
［参考例３］
＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性＞
参考例２で得られたＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の組換え酵素の粗酵素液とし、この粗酵素液のメチルトランスフェラーゼ酵素活性を調べた。
具体的には、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、及び５０％ 粗酵素液となるように、酵素反応液３ｍｌを調製し、この酵素反応液を３７℃、１６時間インキュベートし、反応させた。反応後の酵素反応液を、参考例１の＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して分析した結果、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３,５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成が確認できた。
これらの結果から、参考例２において大腸菌内で発現させた組換え酵素が、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有していることが確認された。
【００８３】
［参考例４］
＜菌糸体抽出粗酵素液を用いたメチル化体の製造＞
参考例１と同様にして、エノキタケ菌糸体培養液の菌糸体から抽出し、得られた抽出物の６０％〜８０％硫酸アンモニウム画分を脱塩処理したものを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液とした。
具体的には、まず、エノキタケ菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を乳鉢にて破砕した後、上記粗酵素溶解液に懸濁して、超音波破砕し、遠心分離して上清を回収した。この上清に、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して上清を回収した。さらに、この回収した上清に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を、粗酵素溶解液に溶解した後、ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて脱塩した。この脱塩サンプルを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液とした。
得られた粗酵素液の各種基質に対するメチルトランスフェラーゼ活性を確認した。酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ 基質、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを３７℃、６時間反応させた。基質には、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキン−３−Ｏ−ガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、カフェ酸、クロロゲン酸、エラグ酸、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、ミリセチン、又はロスマリン酸を、それぞれ用いた。
反応後の酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を、下記の条件でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。標品と比較分析が可能なものについては同定も行った。ＨＰＬＣ条件及びＭＳ条件を以下に示す。
【００８４】
・ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件（ｉ）：８％Ｂ液（２０分間)→２５％Ｂ液（８８分間)
グラジエント条件（ｉｉ）：８％Ｂ液（１０分間)→５０％Ｂ液（３１分間)
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００８５】
・ＭＳ条件
検出器：ＡＰＩ３０００（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン源：ＥＳＩ（ネガティブ）
カーテンガス：１０
ネブライザーガス：１４
ターボガス：６ｌ／ｍｉｎ
イオンスプレー電圧：−４０００Ｖ
イオンスプレー温度：５００度
コーン電圧：−４１Ｖ
【００８６】
ＬＣ−ＭＳ分析の結果を表１に示す。この結果、用いた全ての基質に対して、メチル化体の生成が確認された。これらの結果から、本発明の酵素は、水酸基を有する各種化合物を基質とし、メチル基を修飾することが可能であることが明らかとなった。
また、ＥＣＧのように、化合物中に複数の水酸基を有する化合物の中には、複数種類のメチル化体の生成が確認され、かつ、ジメチル化体も確認された。この結果から、本発明の酵素は、基質の化合物中の複数の水酸基のそれぞれを独立にメチル化可能であることも確認された。
【００８７】
【表１】
【００８８】
［参考例５］
＜反応時間の検討＞
参考例４で用いたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液（以下、天然型酵素）と、参考例２で用いたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素のヒスチジンタグ精製した組換え酵素液（以下、組換え酵素）とを用いて、酵素反応の反応時間を検討した。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３０ｍｌに対して２．５ｍｌ）とし、全量３０ｍｌを３７℃で反応させた。反応開始から５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、２時間、 ４時間、６時間、８時間、２４時間後に、酵素反応液を１ｍｌずつ分取した。これらの酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を、下記のＨＰＬＣ条件で分析した。
【００８９】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件：１０％Ｂ液（１０分間)→１６％Ｂ液（５０分間)
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００９０】
各反応時間後に分取した酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図５に示す。図５（Ａ）が天然型酵素の結果であり、（Ｂ）が組換え酵素の結果である。この結果、天然型酵素では反応開始８時間後で、組換え酵素では２０分後で、ＥＧＣＧメチル化体の生成が最も高い値を示した。
【００９１】
［参考例６］
＜最適ｐＨの検討＞
参考例５において用いた天然型酵素及び組換え酵素の酵素反応における最適ｐＨを調べた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭの各種緩衝液に、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）となるように添加して調製した。用いた緩衝液は、酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．５)、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５〜１０)である。調製した酵素反応溶液の全量３ｍｌを、３７℃で反応させた。反応時間は、天然型酵素で６時間、組換え酵素で１０分間とした。これらの酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を分析した。
各ｐＨの酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図６に示す。この結果、天然型酵素ではｐＨ６．５〜８．５で、組換え酵素ではｐＨ６以上で、ＥＧＣＧメチル化体の生成が確認された。
【００９２】
［参考例７］
＜最適温度の検討＞
参考例５で用いた天然型酵素及び組換え酵素の酵素反応における最適温度を調べた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを、４、１０、２０、３０、３７、４２、５０、又は６０℃で、それぞれ反応させた。反応時間は、天然型酵素で６時間、組換え酵素で１０分間とした。これらの酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を分析した。
各温度における酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図７に示す。この結果、天然型酵素では１０〜５０℃において、組換え酵素では行った全ての温度において、ＥＧＣＧメチル化体の合成が確認された。中でも、３０〜４２℃で、両酵素のいずれにおいても良好な酵素活性が確認された。
【００９３】
［参考例８］
＜基質となるテアフラビン標準品の調製＞
島根県出雲産の紅茶（商品名：出雲国産紅茶（リーフ）、西製茶所製）を粉砕し、４０倍量の２％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸含有５０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ水溶液を用いて、２０分間の室温抽出を３回行った。抽出液は遠心分離を行い、抽出液から茶葉を取り除いた。抽出液は、減圧濃縮により有機溶媒を除去した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８（ウォーターズ社製）に供し、１５％、４０％、１００％ＥｔＯＨステップワイズ溶出を行った。テアフラビンが含まれる４０％ＥｔＯＨ画分を凍結乾燥させ、適宜４０％ＥｔＯＨに再溶解し、下記の条件によりテアフラビンの分取を行った。分取したテアフラビンはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８を用いて脱酸し、凍結乾燥品を作製した。これにより、ＴＦ３Ｇ標準品、ＴＦ３’Ｇ標準品、ＴＦ３，３’Ｇ標準品が得られた。
【００９４】
分取条件；
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２０ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）移動相Ａ：０．０５（ｖ／ｖ）％リン酸水溶液
移動相Ｂ：１２．５（ｖ／ｖ）％酢酸エチルを含むアセトニトリル
グラジエント条件：２４％Ｂ液（５０分間)→５０％Ｂ液（０．１分間）→５０％Ｂ液（１０分間）
流速：１８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００９５】
［実施例１］
＜メチル化テアフラビンの製造＞
参考例２において製造した組換え酵素を用いて、メチル化テアフラビンの製造を行った。基質としては、参考例８で得られたＴＦ３Ｇ標準品、ＴＦ３’Ｇ標準品、ＴＦ３，３’Ｇ標準品をそれぞれ用いた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％（ｗ／ｖ）テアフラビン（基質）、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸、及びメチルトランスフェラーゼ（全量１０００ｍｌに対して３３．３ｍｌ）とし、３７℃、６時間で反応させた。その後、酵素反応液１０００ｍｌに対し、２４ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを加え、酵素反応を終了させた。酵素反応液に等量の酢酸エチルを加えて激しく撹拌し、静置後、酢酸エチル層を回収した。残る水層に対し、再度同様の操作を行った。回収した酢酸エチル層は減圧濃縮した後、参考例８と同じ条件でメチル化テアフラビンの分取を行った。分取したメチル化テアフラビンは、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８を用いて脱酸し、凍結乾燥品を作製した。得られたメチル化テアフラビン凍結乾燥品に対して下記の条件でＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、得られた精密分子量から分子式を算出した。また、下記の条件でＮＭＲ（Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ）を測定し、構造同定を行った。
【００９６】
ＴＯＦ−ＭＳ条件；
検出器：ＱＳＴＡＲ ＥＬＩＴＥ（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン源：ＥＳＩ（ネガティブモード）
カーテンガス：３０
イオンソースガス１：５０
イオンソースガス２：５０
イオンスプレー電圧：−４５００Ｖ
イオンスプレー温度：４５０℃
デクラスタリングポテンシャル：−３０Ｖ
フォーカスポテンシャル：−２５０
デクラスタリングポテンシャル：−１５Ｖ
【００９７】
ＮＭＲ条件；
検出器：ＸＷＩＮ−ＮＭＲ ＡＶ６００（ブルカーバイオスピン社）
プローブ温度：３００Ｋ
溶媒：アセトン−ｄ６
【００９８】
ＴＯＦ−ＭＳ、及びＮＭＲ解析の結果を表２〜４に示した。既知化合物である３ＭｅＴＦ３Ｇの他に８種の新規化合物が得られた。各新規化合物をそれぞれ、３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇ（化学式（Ｉ）−１）、３ＭｅＴＦ３’Ｇ（化学式（ＩＩ）−１）、４ＭｅＴＦ３’Ｇ（化学式（ＩＩ）−２）、３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ（化学（ＩＩ）−３）、３，４ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ（式（ＩＩ）−４）、３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ（化学式（ＩＩＩ）−１）、４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ（化学式（ＩＩＩ）−２）、３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇ（化学式（ＩＩＩ）−３）と決定した。
【００９９】
【表２Ａ】
【０１００】
【表２Ｂ】
【０１０１】
【表３Ａ】
【０１０２】
【表３Ｂ】
【０１０３】
【表３Ｃ】
【０１０４】
【表４Ａ】
【０１０５】
【表４Ｂ】
【０１０６】
［実施例２］
＜メチル化テアフラビン含有紅茶ポリフェノールの製造、及び反応効率＞
標準品に代えて参考例８において調製した４０％ＥｔＯＨ画分の凍結乾燥品を基質として、実施例１と同様に酵素反応を行った。酵素反応液は経時的に０．５ｍｌずつ取り分け、実施例１と同様に処理した後、下記の条件で分析することにより、テアフラビンとメチル化テアフラビンの組成を調べた。
【０１０７】
分析条件；
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）移動相Ａ：０．０５（ｖ／ｖ）％リン酸水溶液
移動相Ｂ：１２．５（ｖ／ｖ）％酢酸エチルを含むアセトニトリル
グラジエント条件：２４％Ｂ液（５０分間)→５０％Ｂ液（０．１分間）→５０％Ｂ液（１０分間）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ３７５ｎｍ
【０１０８】
メチル化テアフラビン含有紅茶ポリフェノールの製造過程において、テアフラビンとメチル化テアフラビンの組成の推移を経時的に調べた結果を図８に示す。この結果、反応時間の経過とともにメチル化テアフラビンの生成量は増加し、２４時間後で生成量が最大になることが明らかになった。この結果から、メチルトランスフェラーゼを用いた酵素処理によって、紅茶ポリフェノール中のメチル化テアフラビン含量を増やすことが可能であることが明らかとなった。
【０１０９】
［実施例３］
＜メチル化テアフラビンのｐＨ安定性評価＞
実施例１で用いたテアフラビン標準品及び実施例１で得られたメチル化テアフラビンを、４００μＭになるように、４０％（ｖ／ｖ）エタノール含有０．３Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）又は４０％（ｖ／ｖ）エタノール含有０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５)にそれぞれ溶解し、常温におけるｐＨ安定性を調べた。反応開始０、１、２時間後に試料を５０μｌずつ採取し、等量の１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸水溶液を添加して分解反応を停止させ、 ４０％（ｖ／ｖ）になるようにＥｔＯＨを加え、残存する各種テアフラビンを実施例２に記載の方法で分析した。
【０１１０】
反応開始２時間後のメチル化テアフラビン残存率を図９に示す。図９（Ａ）がｐＨ５．０の結果であり、図９（Ｂ）がｐＨ７．５の結果である。この結果、ポリフェノールが安定とされるｐＨ５．０では、全ての化合物がほぼ１００％残存していた。一方、ポリフェノールが不安定とされるｐＨ７．５では、メチル化テアフラビンはテアフラビンよりも良好なｐＨ安定性を有していた。また、評価した全ての化合物において、メチル基の数が増えるほど、ｐＨ安定性が高まることが明らかになった。
【０１１１】
［実施例４］
＜メチル化テアフラビンのヒト肝組織由来Ｓ９フラクションを用いた代謝安定性試験＞
ヒト肝組織由来のＳ９フラクション（シグマ アルドリッチ社製）を用いて、実施例１で用いたテアフラビン標準品及び実施例１で得られたメチル化テアフラビンの代謝安定性を評価した。
反応組成は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホサルフェート、１ｍＭ ウリジン−５’二リン酸−α−Ｄ−グルクロン酸、１ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０６３％ ウシ血清アルブミン、８ｍＭ ＤＴＴ、ヒト肝組織由来Ｓ９フラクション（最終量５０μｇタンパク質）、５μＭ 各種テアフラビン又はメチル化テアフラビンからなる反応液２５０μｌを調製し、３７℃でインキュベートした。反応開始０、１５、３０、６０分後に５０μｌずつ分取し、４５μｌの氷冷したメタノールと、５μｌの１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸水溶液とを加えて攪拌した。その後、１４，０００ｇで３分間遠心分離し、得られた上清から９０μｌを回収し、残存する各種テアフラビンを実施例２に記載の方法で分析した。
【０１１２】
反応開始６０分後の、各種テアフラビン残存率を図１０に示す。その結果、いずれのメチル化テアフラビンも、対応するテアフラビンと比較して残存率が高く、良好な代謝安定性を示した。また、評価した全ての化合物において、メチル基が増えるほどその代謝安定性が向上することが明らかになった。
【０１１３】
［実施例５］
＜メチル化テアフラビンの脂肪蓄積抑制作用評価＞
ＴＦ３Ｇのメチル化体の脂肪蓄積抑制作用を調べた。Ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ（参考例８において、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８に供する前の抽出液）、実施例１で用いたＴＦ３Ｇ（標準品）、実施例１で得られた３ＭｅＴＦ３Ｇ及び３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを被検素材とした。
【０１１４】
まず、ヒト臓器脂肪由来前駆脂肪細胞（Ｌｏｔ．Ｎｏ．８Ｆ３４８２，三光純薬社製）を、前駆脂肪細胞用増殖培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養し、増殖させた。その後、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）に前駆脂肪細胞を１．５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように撒いて２４時間培養した後、培地を前駆脂肪細胞用分化培地に交換して分化を誘導した。分化誘導と同時に、最終濃度がＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔは１０μｇ／ｍｌ、各被検素材は１又は３μＭとなるようにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解して添加した。その後、１日おきに、前駆脂肪細胞用分化培地にＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔは１０μｇ／ｍｌ、各被検素材は１又は３μＭとなるように含有させた培地に交換し、１０日間培養した。培養終了後、細胞内の脂肪蓄積量をＡｄｉｐｏＲｅｄａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）を用いて蛍光強度により評価した（Ｅｘ：４８５ｎｍ， Ｅｍ：５７２ｎｍ）。
【０１１５】
各処理を施した細胞群の脂肪蓄積量の測定結果を図１１に示す。図１１（Ａ）は各被検素材を１μＭとなるように培地中に添加した場合の結果を、図１１（Ｂ）は３μＭとなるように培地中に添加した場合の結果を、それぞれ示す。この結果、ＴＦ３Ｇ、３ＭｅＴＦ３Ｇ、又は３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを添加した場合には、無添加の場合やＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔを添加した場合よりも数値が低く、脂肪蓄積が抑制されていることが明らかとなった。また、３ＭｅＴＦ３Ｇ及び３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇは、非メチル化体であるＴＦ３Ｇよりも脂肪蓄積抑制作用が強く、中でも、３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇは、既知化合物である３ＭｅＴＦ３Ｇよりも優れた脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。
これらの結果から、テアフラビンのうち、少なくともＴＦ３Ｇにおいては、メチル化されている水酸基の数が多くなるほど、脂肪蓄積抑制作用が高まることが明らかになった。
【０１１６】
［実施例６］
＜メチル化テアフラビンの抗酸化作用評価＞
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２への過酸化水素水による酸化ストレスに対する、メチル化テアフラビンの抑制効果を評価した。Ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ（参考例８において、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８に供する前の抽出液）、実施例１で用いたＴＦ３’Ｇ及びＴＦ３，３’Ｇ（標準品）、並びに実施例１で得られた３ＭｅＴＦ３’Ｇ、３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ、３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、及び３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇを被検素材とした。これらの被検素材は、予めＤＭＳＯに溶解させた。
【０１１７】
ＨｅｐＧ２細胞は、１０％非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有Ｄ−ＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて継代培養した。その後、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）にＨｅｐＧ２細胞を４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように撒き、最終濃度がＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔは０．６、６、６０μｇ／ｍｌ、被検素材は０．２、２、又は２０μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解して添加したＤ−ＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２３時間培養した。培地を除去した後、各ウェルに１５０μｌの１２ｍＭ 過酸化水素水含有Ｄ−ＭＥＭ培地を添加し、細胞を２時間、過酸化水素水に暴露した。その後、上清を除去した各ウェルに、２００μｌの１０％アラマーブルー含有Ｄ−ＭＥＭ培地を添加し、３時間培養後、蛍光強度を測定した（Ｅｘ：５４４ｎｍ， Ｅｍ：５９０ｎｍ）。
【０１１８】
過酸化水素水を添加しなかった場合のＨｅｐＧ２細胞生存率を１００％とし、各濃度の被検素材を添加した場合におけるＨｅｐＧ２細胞生存率を求めた。ＨｅｐＧ２細胞生存率の測定結果を図１２に示す。図１２（Ａ）がＴＦ３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果であり、図１２（Ｂ）がＴＦ３，３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果である。なお、有意差の検定はＴｕｋｅｙ法を用いた。
【０１１９】
過酸化水素水のみを添加した場合やＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔを添加した場合と比較した結果、テアフラビンを添加した場合に差は確認できなかったものの、メチル化テアフラビンを添加した場合は細胞生存率がほぼ１００％であり、有意に酸化ストレスが抑制されることが判明した。特に、ＴＦ３’Ｇ及びＴＦ３，３’Ｇにおいては、メチル化テアフラビンのほうが、非メチル化体よりも高い抗酸化作用を有することが確認された。
なお、各被検素材を２又は２０μＭとなるように添加した場合には、非メチル化体と各種メチル化体の間で有意な差は得られなかった。これは、過酸化水素水濃度等の処理条件により、抗酸化作用の効果が必要十分であったためと推察される。
【０１２０】
なお、参考例１〜８及び実施例１〜６において使用した試薬の購入先は、以下の通りである。
Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ：日本ベクトン・ディッキンソン
Ｐｅｐｔｏｎｅ: 日本ベクトン・ディッキンソン
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ：日本ベクトン・ディッキンソン
前駆脂肪細胞用増殖培地：三光純薬
Ｄ−ＭＥＭ培地：和光純薬
分化培地：三光純薬
アラマーブルー:インビトロジェン
ＦＣＳ：ＪＲＨバイオサイエンス
ペニシリン：ＧＩＢＣＯ
ストレプトマイシン：ＧＩＢＣＯ
ＥＧＣＧ：テアビゴ、ＤＳＭニュートリションジャパン
【０１２１】
エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）：フナコシ
カテキン−３−Ｏ−ガレート（ＣＧ）：フナコシ
ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）：フナコシ
カフェ酸：シグマ
クロロゲン酸：フナコシ
エラグ酸：フナコシ
ブテイン：フナコシ
スルフレチン：フナコシ
ルテオリン：フナコシ
ミリセチン：フナコシ
ロスマリン酸：フナコシ
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の新規メチル化テアフラビンは、安定性及び機能性に優れているため、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な商品の製造分野において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有する新規なメチル化テアフラビンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の果実や葉等に主に含まれている成分の１つに、ポリフェノールがある。ポリフェノールとしては、例えば、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、イソフラボン類、アントシアニン類、フラバノール類、エラジタンニン類、フェニルプロパノイド類、アントシアニジン類、プロアントシアニジン類、カルコン類、オーロン類、フェニルエタノイド類等が挙げられる。より具体的には、没食子酸、エラグ酸、ヒドロキシチロソール、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキン−３−Ｏ−ガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、カテキン（Ｃ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、ガロカテキン（ＧＣ）、クロマニン、デルフィニジン、デルフィニジン３−Ｏ−グルコシド、プロシアニジンＢ２（ＰＢ２）、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸、カフェ酸フェネチルエステル、ストリクチニン、ケルセチン、イソクエルシトリン、ルチン、ミリセチン、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、エリオジクチオール等が挙げられる。これらのポリフェノールは、その構造に複数のフェノール性水酸基を持つことを特徴とし、抗酸化活性、血圧上昇抑制、血糖値上昇抑制、内脂肪蓄積抑制、動脈硬化抑制、抗炎症作用、抗がん性、アレルギー抑制、抗う蝕作用、消臭作用、抗菌活性等の様々な機能性が研究、報告されている。また、これらのポリフェノール以外にも、植物由来の成分に関して、様々な機能性が研究、報告されている。
【０００３】
これらのポリフェノールの中でも、水酸基にメチル基が修飾されたメチル化ポリフェノールは、メチル基で修飾されていないポリフェノールに比べて、吸収性、代謝安定性、機能性等に優れているという報告が多くなされている。例えば、茶品種“青心大ぱん”、“べにほまれ”、“べにふじ”、“べにふうき”等には、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート(ＥＧＣＧ３”Ｍｅ)やエピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣＧ４”Ｍｅ)が含まれているが、これらのメチル化カテキンをマウスへ経口投与した場合の、投与６０分後の血中メチル化カテキン濃度は、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）と比較して、遊離体で約９倍高い値を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、７−ヒドロキシフラボン、７，４’−ジヒドロキシフラボン、クリシン、アピゲニンとこれらのメチル化体を比較したところ、メチル化体のほうが、Ｃａｃｏ−２細胞を用いたヒト腸管吸収モデル試験において高い吸収性を示し、ヒト肝組織由来Ｓ９フラクションを用いた代謝安定性試験において良好な結果を示すことも報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。さらに、マウスマスト細胞を用いたヒスタミン遊離抑制試験に関しては、ＥＧＣＧ３”Ｍｅ、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、及びエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートは、ＥＧＣＧと比較して高い抗アレルギー作用を示し、かつメチル基の増加に伴ってその作用は強まる傾向を示したことも報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
紅茶ポリフェノールの一種であるテアフラビンにも、脂肪吸収抑制作用、抗酸化作用、血糖値上昇抑制作用や抗腫瘍作用等の様々な機能性が報告されている。これらの機能を生体内で効果的に発揮させるためには、十分量のテアフラビンを摂取することが重要だと考えられる。しかしながら、紅茶中のテアフラビン含量は少なく、かつ、酸化によって分解されやすい。このため、紅茶をそのまま飲食したとしても、テアフラビンを大量かつ安定的に摂取することは難しい。
【０００５】
カテキンと同様にメチル化することにより、テアフラビンの代謝安定性や機能性を改善し得ると考えられる。実際に、紅茶においても、メチル化ポリフェノールの一種であるメチル化テアフラビンが含まれていることが報告されているが、その含量は乾燥茶葉中に約０．０５％と通常のテアフラビンよりもさらに少ない（例えば、非特許文献３参照。）。
このため、メチル化テアフラビンを紅茶から大量に得ることは困難である。
【０００６】
メチル化テアフラビンを人為的に得る方法としては、エピガロカテキン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート等のメチル化カテキン、エピカテキン、及びエピカテキンガレートを原料として、酸化酵素により重合させる方法がある（例えば、非特許文献３参照。）。
しかしながら、天然に希少なメチル化カテキンを原料として使用するこのような方法では、そもそも原料を得ること自体が難しいことに加えて、合成されるメチル化テアフラビンは、原料となるメチル化カテキンの種類に依存する。このため、現在までに、テアフラビン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、テアフラビン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート，３’−Ｏ−ガレートしか得られていない。また、非特許文献３においては、メチル化テアフラビンの機能性は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１８９６２８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】サノ（Sano）、外３名、フレグランス・ジャーナル（FRAGRANCE JOURNAL）、２０００年、４号、第４６〜５２ページ。
【非特許文献２】ウェン（Wen）、外１名、ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metabolism and Disposition）、２００６年、第３４巻第１０号、第１７８６〜１７９２ページ。
【非特許文献３】ニシムラ（Nishimura）、外５名、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー(Journal of Agricultural and Food Chemistry) ２００７年、第５５巻、第７２５２〜７２５７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
テアフラビン等のポリフェノール類は、非常に多くの機能を有しているが、これらの機能は、ポリフェノールの種類によって異なる場合がある。同様に、メチル化ポリフェノールにおいても、ポリフェノール中のいずれの水酸基をメチル化するかによって、その作用効果や活性強度が異なる可能性が高い。このため、様々なテアフラビン類をメチル化することにより、より代謝安定性や機能性に優れたメチル化テアフラビンを得ることができると期待される。
【００１０】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有し、安定性や機能性に優れた新規なメチル化テアフラビンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、テアフラビンをはじめとするポリフェノールの水酸基を効率よくメチル化することができる新規なメチルトランスフェラーゼを得、当該酵素を用いてテアフラビンを基質とした酵素反応法を行なうことにより、新規なメチル化テアフラビンを合成することにより、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１） １又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有するメチル化テアフラビンであって、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする化合物、
【化１】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【化２】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【化３】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【００１３】
（２） 下記式（Ｉ）−１、（ＩＩ）−１〜４、及び（ＩＩＩ）−１〜３からなる群より選択される１の式で表されることを特徴とする、前記（１）に記載の化合物、
【化４】
【化５】
【化６】
【００１４】
（３） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物、
（４） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする脂肪蓄積抑制剤、（５） 前記化合物が前記式（Ｉ）−１で表される化合物であることを特徴とする前記（４）記載の脂肪蓄積抑制剤、
（６） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする抗酸化剤、
（７） 前記化合物が、前記式（ＩＩ）−１、（ＩＩ）−３、（ＩＩＩ）−１、（ＩＩＩ）−２、及び（ＩＩＩ）−３で表される化合物から選択される１種以上であることを特徴とする前記（６）記載の抗酸化剤、
（８） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする飲食品、
（９） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬品又は医薬部外品、
（１０） 前記（１）又は（２）に記載の化合物を含むことを特徴とする化粧品、
（１１） 下記式（Ｉ）−０で表される化合物、下記式（ＩＩ）−０で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩ）−０で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を基質として、メチルトランスフェラーゼ酵素を反応させることにより、前記一般式（Ｉ）で表される化合物、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物、及び前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を合成することを特徴とする、メチル化テアフラビンの製造方法、
【化７】
（１２） 前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の酵素であることを特徴とする前記（１１）記載のメチル化テアフラビンの製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のメチル化テアフラビンは、非メチル化体であるテアフラビンと同様の生理機能を有する上に、非常に良好なｐＨ安定性及び代謝安定性を有する。このため、本発明のメチル化テアフラビンを飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な商品へ応用することにより、非メチル化体を使用するよりも、機能性や経済性に優れた製品の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示した図である。
【図２】図２（Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、上記２種類の担子菌の遺伝子と、相同性検察の結果相同性が高かった上位４遺伝子とのアミノ酸配列を比較した結果である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）中の１〜４に示す領域から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列であると推定された配列を表す図である。
【図３】参考例１において、エノキタケ菌糸培養物から分画されたメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する活性画分の二次元電気泳動像である。
【図４】参考例２において、ＩＰＴＧ処理前の大腸菌のライセート（レーン１）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセート（レーン２）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートからヒスチジンタグを用いて得られた精製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。
【図５】参考例５において、各反応時間後に分取した酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。図５（Ａ）が天然型酵素の結果であり、図５（Ｂ）が組換え酵素の結果である。
【図６】参考例６において、各ｐＨの酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図７】参考例７において、各温度の酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図８】実施例２において、メチル化テアフラビン含有紅茶ポリフェノールの製造過程におけるテアフラビンとメチル化テアフラビンの組成を経時的に測定した結果を示した図である。
【図９】実施例３において、各種テアフラビン及びメチル化テアフラビンの残存率を反応開始２時間後に測定した結果を示した図である。図９（Ａ）がｐＨ５．０の結果であり、図９（Ｂ）がｐＨ７．５の結果である。
【図１０】実施例４において、各種テアフラビン及びメチル化テアフラビンの残存率を反応開始６０分後に測定した結果を示した図である。
【図１１】実施例５において、各処理を施した細胞群の脂肪蓄積量の測定結果を示した図である。図１１（Ａ）は各被検素材を１μＭとなるように培地中に添加した場合の結果であり、図１１（Ｂ）は３μＭとなるように培地中に添加した場合の結果である。
【図１２】実施例６において、ＨｅｐＧ２細胞生存率の測定結果を示した図である。図１２（Ａ）がＴＦ３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果であり、図１２（Ｂ）がＴＦ３，３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明及び本願明細書において使用する各化合物の略称を以下に示す。
ＴＦ：テアフラビン
ＴＦ３Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート
３ＭｅＴＦ３Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート
３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート
ＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−ガレート
３ＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート
４ＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート
３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート３，４ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ：テアフラビン３’−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレートＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３，３’ −ジ−Ｏ−ガレート
３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート,３’−Ｏ−(３−Ｏ−メチル)ガレート
４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート,３’−Ｏ−(４−Ｏ−メチル)ガレート
３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇ：テアフラビン３−Ｏ−ガレート,３’−Ｏ−(３，５−Ｏ−ジメチル)ガレート
Ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ：紅茶抽出物、紅茶エキス
【００１８】
本発明及び本願明細書において、テアフラビンとは、下記式（Ｉ）−０で表される化合物（ＴＦ３Ｇ）、下記式（ＩＩ）−０で表される化合物（ＴＦ３’Ｇ）、又は下記式（ＩＩＩ）−０で表される化合物（ＴＦ３，３’Ｇ）を示す。なお、これらの式で表される化合物は複数の異性体を有しているが、これらの異性体も、テアフラビンに含まれる。
また、本発明及び本願明細書において、メチル化テアフラビンとは、テアフラビンのガロイル基中の少なくとも１の水酸基がメチル化されている化合物を意味する。
【００１９】
【化８】
【００２０】
＜新規メチルトランスフェラーゼ＞
本発明者らは、新規なメチル化テアフラビンを合成するために、後記参考例１等に示すように、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の新規なメチルトランスフェラーゼを単離・同定した。
得られたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）及び対応するアミノ酸配列（配列番号２）を図１に示す。配列番号１で表される塩基配列の４５位〜７３４位がコーディング領域である。
【００２１】
なお、配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、公開されているＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースを用いてホモロジー検索を行った結果、最も相同性の高い遺伝子はオオキツネタケ由来遺伝子Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２（アクセッション番号：ＸＭ＿００１８７８８０３）であり、塩基配列で６３．６％、アミノ酸配列で６１．６％程度の相同性であった。
【００２２】
また、全ゲノム配列が判明している担子菌類であるモデルキノコのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｈｃｈｒ１／Ｐｈｃｈｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を用いて、同様にホモロジー検索を行った結果、最も相同性の高い遺伝子はＯ-メチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：１２７１１５）であり、塩基配列で６３．９％、アミノ酸配列で５６．８％程度の相同性であった。
【００２３】
図２（Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、上記２種類の担子菌の遺伝子と、相同性検察の結果相同性が高かった上位４遺伝子とのアミノ酸配列を比較した結果である。図２（Ａ）中、「Ｆ．ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ」は配列番号２で表されるアミノ酸配列を表す。また、「Ｌ．ｂｉｃｏｌｏｒ Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２」はオオキツネタケ由来遺伝子Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２、「Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ」はモデルキノコ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、「Ｂ．ｉｎｄｅｉｃａ ｓｕｂｓｐ．」はＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿００１８３２７９７）、「Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ」はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿７７７３１０）、「Ｂ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ」はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＭＳＭＢ４３由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＺＰ＿０２４６６６０９）、及び「Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ」はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９４由来遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿００１４３７７８５）の推定アミノ酸配列をそれぞれ表す。
【００２４】
本発明者らは、このアラインメントから、図２（Ａ）中、１〜４に示す領域が、全７種類の遺伝子において保存性の高い領域であることを見出した。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列中、領域１は７０〜８８番目の領域であり、領域２は１３９〜１４８番目の領域であり、領域３は１７１〜１７５番目の領域であり、領域４は２１５〜２２３番目の領域である。さらに本発明者らは、これらの４領域のアミノ酸配列から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列を推定した。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）中の１〜４に示す領域から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列であると推定された配列を表す。なお、図２（Ｂ）中、「ｘ」はいずれのアミノ酸残基であってもよいことを意味し、「（／）」は、括弧内のいずれかのアミノ酸残基であることを意味する。
【００２５】
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、ＮＣＢＩデータベースを用いて植物由来のメチルトランスフェラーゼ酵素とのホモロジー検索を行った結果、ダイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＡＹ２７９００４）と、塩基配列で５３．９％、アミノ酸配列で３０．４％の相同性であった。同様に、イネ（Ｏｌｙｚａｓａｔｉｖａ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＡＹ２７９００４）と５０．７％（塩基配列）及び３０．０％（アミノ酸配列）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＭＮ＿１１６０６５）５２．３％（塩基配列）及び３０．８％（アミノ酸配列）程度の相同性であった。さらに、特許文献４に記載の、茶から単離されたＥＧＣＧをメチル化可能なメチルトランスフェラーゼ酵素と比較した結果、塩基配列で５３．９％、アミノ酸配列では３０．４％程度の相同性であった。
【００２６】
本発明者らは、テアフラビンを基質とし、同定したエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼによる酵素反応によって、メチル化テアフラビンを得た。この結果、公知のメチル化テアフラビンである３ＭｅＴＦ３Ｇ以外にも、多くの新規なメチル化テアフラビンを得た。
【００２７】
すなわち、本発明のメチル化テアフラビンは、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする。
【００２８】
【化９】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【００２９】
【化１０】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【００３０】
【化１１】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【００３１】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。
一般式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。
一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。
なお、これらの一般式で表される化合物は複数の異性体を有しているが、これらの一般式で表される化合物である限り、いずれの異性体も、本発明のメチル化テアフラビンに含まれる。
【００３２】
本発明のメチル化テアフラビンとしては、特に、式（Ｉ）−１で表される化合物（３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇ）、式（ＩＩ）−１で表される化合物（３ＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩ）−２で表される化合物（４ＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩ）−３で表される化合物（３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩ）−４で表される化合物（３，４ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ）、式（ＩＩＩ）−１で表される化合物（３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ）、式（ＩＩＩ）−２で表される化合物（４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ）、及び式（ＩＩＩ）−３で表される化合物（３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇ）であることが好ましい。
【００３３】
【化１２】
【００３４】
【化１３】
【００３５】
【化１４】
【００３６】
本発明のメチル化テアフラビンは、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼを用いた酵素反応により初めて合成されたものである。紅茶にはテアフラビンが含まれており、かつ生茶葉由来のメチルトランスフェラーゼも公知である（例えば、特開２００７−３０６８０６号公報）。にもかかわらず、今までこれらのメチル化テアフラビンが得られていなかった理由は明らかではないが、生茶葉由来メチルトランスフェラーゼがカテキン類に対する特異性が高く、テアフラビン類に対する特異性が十分ではない可能性や、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの酵素活性が、生茶葉由来メチルトランスフェラーゼ等の公知のメチルトランスフェラーゼよりも高い可能性がある。
【００３７】
本発明のメチル化テアフラビンは、テアフラビンをメチルトランスフェラーゼによりメチル化することによって製造することができる。より具体的には、例えば、１種類又は２種類以上のメチルトランスフェラーゼを、ｐＨ５〜１２、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ６．５〜８．５の緩衝液に懸濁し、さらにテアフラビン含有物とメチル基の供与体とを加えて、０〜８０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは３０〜４２℃で反応させることにより、酵素反応液中にメチル化体を得ることができる。なお、テアフラビン含有物としては、紅茶、紅茶抽出物、紅茶ポリフェノール、テアフラビン標準品等を用いることができる。また、メチル基の供与体としては、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ (ＳＡＭ)等の、一般的にフェノール性水酸基のメチル化の際に用いられる物質の中から、適宜選択して用いることができる。
【００３８】
本発明のメチル化テアフラビンを製造するために用いられるメチルトランスフェラーゼとしては、テアフラビンのガロイル基中の水酸基をメチル化できる酵素であれば特に限定されるものではなく、フェノール性水酸基をメチル化することが可能な一般的なメチルトランスフェラーゼの中から適宜選択して用いることができる。このようなメチルトランスフェラーゼとして、例えば、微生物由来や植物体由来のメチルトランスフェラーゼ、ラット、豚、牛肝臓由来のカテコールメチルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００３９】
本発明のメチル化テアフラビンを製造するためには、担子菌類の子実体又は菌糸体から得たメチルトランスフェラーゼを利用することが好ましく、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ又は当該酵素の他の担子菌類由来のホモログであることがより好ましく、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼであることが特に好ましい。
【００４０】
エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの他の担子菌類由来のホモログは、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは５５％以上、さらに好ましくは６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００４１】
なお、塩基配列とアミノ酸配列の相同性検索をする場合には、一般的に、最初にＧＡＰを考慮せずホモロジーの核となる部分を探し、そこからアライメント処理を行う方法（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｓｅａｒｃｈ）と、置き換えや欠損を考慮しながら、塩基（アミノ酸）配列間で一致する塩基（アミノ酸残基）対が最大になるように並べ替える方法（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇ）とがある。本発明及び本願明細書における「相同性」の値は、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇを用いて解析し、得られる値を示す。Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇによる相同性検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１．０（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）等の汎用されている解析ソフトウェアを用いて行うことができる。
【００４２】
メチル化テアフラビンの製造に用いられるメチルトランスフェラーゼは、天然の酵素であってもよく、公知の遺伝子組換え技術等を用いて製造された組換え酵素であってもよい。組換え酵素としては、天然の酵素と同一のアミノ酸配列を有するものであってもよく、天然の酵素に対して１以上のアミノ酸を置換・欠失・付加したアミノ酸配列からなり、かつメチルトランスフェラーゼ酵素活性を保持している改変体であってもよい。また、これらのメチルトランスフェラーゼとしては、市販のものを用いてもよい。
【００４３】
天然のメチルトランスフェラーゼは、当該酵素を含む生物体から抽出し、精製することにより、得ることができる。生物体からの精製方法は、特に限定されるものではなく、一般的に行われる公知の精製方法の中から、適宜選択して行うことができる。また、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が発揮される状態まで精製すればよく、精製度は特に限定されず、粗精製であってもよい。
【００４４】
例えば、担子菌類の子実体又は菌糸体由来メチルトランスフェラーゼの場合、具体的には、本発明の遺伝子を含む担子菌類の子実体又は菌糸体を、適当な緩衝液中で超音波処理等により破砕した後、回収された上清を粗酵素とすることができる。その他、担子菌類の子実体又は菌糸体を、適当な緩衝液中でホモジナイズした後、上清を回収してもよい。粗酵素を得るための緩衝液としては、例えば、ｐＨ６．５〜８．５のトリス緩衝液やリン酸緩衝液等を用いることができる。
【００４５】
また、酵素を抽出する担子菌類は、採取直後のものであってもよく、市販等されているものであってもよく、培養物であってもよい。なお、担子菌類の菌糸体の培養は、常法により行うことができる。
【００４６】
このようにして得られた粗酵素は、そのまま酵素反応に用いることができる。さらには、遠心分離、限外ろ過膜、塩析、各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより、粗酵素から精製物を得ることもできる。
【００４７】
メチルトランスフェラーゼの組換え酵素は、公知のいずれの手法で製造してもよい。具体的には、メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターを、微生物や培養細胞等の適当な生物体（宿主）に導入し、当該組換え発現ベクターを含む形質転換体を製造する。このようにして得られた形質転換体をそれぞれの生物体の最適な条件で培養することにより、当該形質転換体内にメチルトランスフェラーゼの組換え酵素が生成される。そこで、形質転換体の培養物から抽出し、精製することにより、メチルトランスフェラーゼの組換え酵素を得ることができる。
【００４８】
酵素反応により得られたメチル化テアフラビンは、酵素反応液から、メチル化テアフラビンを抽出することが可能な溶媒等を用いることにより抽出することができる。なお、酵素反応液は、濃縮した後に抽出に用いてもよい。その他、酵素反応液を、合成吸着剤を充填したカラムに供して、メチル化テアフラビンを当該合成吸着剤に吸着させ、さらに洗浄した後、適当な溶媒を用いて溶出させることによっても、メチル化テアフラビンを得ることが可能である。さらにＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製することにより、純度の高い新規なメチル化テアフラビンを製造することも可能である。
【００４９】
本発明のメチル化テアフラビンは、飲食品、医薬品、医薬用部外品及び化粧品を始めとする様々な製品に用いることができる。本発明のメチル化テアフラビンは、これらの製品にそのまま原料として用いてもよく、その他の成分と予め混合することにより得られた組成物を原料として用いてもよい。
【００５０】
本発明のメチル化テアフラビンは、非メチル化体よりも優れたｐＨ安定性及び代謝安定性を有している。このため、本発明のメチル化テアフラビンを各種製品に用いた場合には、非メチル化体を用いる場合と比較して、より少ない添加量で、同等の機能を発揮させることができる。
【００５１】
なお、本発明及び本願明細書において、ｐＨ安定性とは、ｐＨが中性付近の溶液中で保存した場合の分解の受け難さ（安定性）をいう。また、代謝安定性とは、生体内若しくはそれに類する環境下で保存した場合の分解の受け難さをいう。
【００５２】
また、本発明のメチル化テアフラビンは、脂肪蓄積抑制作用や抗酸化作用を有する。このため、本発明のメチル化テアフラビン又はこれを含む組成物を有効成分とすることにより、脂肪蓄積抑制剤や抗酸化剤を製造することができる。なお、脂肪蓄積抑制剤や抗酸化剤に含まれるメチル化テアフラビンは、１種類であってもよく、２種類以上を組み合わせて含ませてもよい。
【００５３】
脂肪蓄積抑制剤としては、特に式（Ｉ）−１で表される３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを有効成分として含むことが好ましい。３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇは、非メチル化体であるＴＦ３Ｇに比べて非常に良好な脂肪蓄積抑制作用を有するためである。脂肪蓄積抑制剤に含有させるメチル化テアフラビンの量は、脂肪蓄積抑制能が発揮される濃度であれば特に限定されるものではなく、メチル化テアフラビンの種類、所望する脂肪蓄積抑制の強度等を考慮して適宜設定することができる。例えば、３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを用いた場合には、０．５〜１０μＭ、好ましくは０．５〜５μＭ、より好ましくは１〜３μＭとすることができる。
【００５４】
抗酸化剤としては、特に式（ＩＩ）−１で表される３ＭｅＴＦ３’Ｇ、式（ＩＩ）−３で表される３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ、式（ＩＩＩ）−１で表される３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、式（ＩＩＩ）−２で表される４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、又は式（ＩＩＩ）−３で表される３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇの少なくとも１種類を有効成分として含むことが好ましい。これらのメチル化テアフラビンは、対応する非メチル化体に比べて非常に良好な抗酸化作用を有するためである。抗酸化剤に含有させるメチル化テアフラビンの量は、抗酸化能が発揮される濃度であれば特に限定されるものではなく、メチル化テアフラビンの種類、所望する抗酸化能の強度等を考慮して適宜設定することができる。例えば、３ＭｅＴＦ３’Ｇ、３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ、３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、又は３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇを用いた場合には、０．１μＭ以上、好ましくは０．１〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜２０μＭ、さらに好ましくは０．２〜２μＭとすることができる。
【００５５】
飲食品、医薬品、医薬用部外品及び化粧品に用いる場合には、エノキタケ等の食用担子菌類から回収されたメチルトランスフェラーゼ酵素を用いて製造されたメチル化テアフラビンを用いることが好ましい。エノキタケ等の食用担子菌類から回収されたメチルトランスフェラーゼ酵素は安全性が高いため、飲食品や医薬品、化粧品等の十分な安全性が要求される製品の工業生産に適している。また、担子菌類は簡便に大量培養（栽培）することができる。
【００５６】
当該メチル化テアフラビン又はその組成物が原料として添加される飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ギョーザの皮、シュウマイの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠果、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水酸・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂加工食品；ソース、タレ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品等を挙げることができる。
【００５７】
本発明のメチル化テアフラビン又はその組成物が原料として添加される医薬品及び医薬部外品の剤型としては、錠剤、液剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等が挙げられる。
また、化粧品としては、洗顔クリーム、化粧水、パック、美容液等の基礎化粧品類；ファンデーション、口紅、アイカラー等のメイクアップ化粧品類；ネイルエナメル、石鹸、入浴剤、サンスクリーン剤、デオドラントスプレー等のボディ化粧品類；シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアームース等の頭髪用化粧品類；育毛剤、養毛剤、ヘアトニック等の頭髪用化粧品類；香水、オーデコロン等の芳香用化粧品類を挙げることが出来る。
【００５８】
これらを製造するにあたり、本発明のメチル化テアフラビン又はその組成物は、通常用いられている補助的な原料や添加物と共に添加することができる。このような原料及び添加物としては、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存料等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
次に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例に限定されるものではない。
【００６０】
［参考例１］
エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離・同定を行った。
＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞
食用として市販されている日本産のシイタケ、シメジ、マイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、ナラタケ、タモギタケ、エリンギ、アワビタケをスクリーニングに用いた。
これらの子実体を用いて柄の部分をカットし、０．５％次亜塩素酸に浸した後、滅菌水で洗浄した。柄の内部から５ｍｍ程度を切り出し、Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ培地上で、２５℃にて培養し、菌糸体を単離した。得られた菌糸体を、菌糸体培養用液体培地（０．０２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．０１％ ｐｅｐｔｏｎｅ、０．００２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．００２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．００１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に接種し、２８℃で旋回培養した。
【００６１】
得られた菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、粗酵素溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加えて超音波破砕した後、遠心分離して上清を回収した。この上清を粗酵素液として酵素活性測定に用いた。
酵素活性測定は、基質としてＥＧＣＧを用い、そのメチル化体の生成量を指標とした。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、及び５０％ 粗酵素液とし、全量３ｍｌを３７℃、１６時間反応させた。
反応後、酵素反応液３ｍｌに、１Ｎ ＨＣｌ ７０μl及び酢酸エチル５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離して有機層を回収した。有機層を窒素で乾固した後、１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸含有３０％メタノール水溶液に溶解し、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００６２】
カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ１８−５（４．６×１５０ｍｍ）及びＣ１８−５（４．６×１０ｍｍ）（和光純薬社製）
移動相Ａ：蒸留水、アセトニトリル、リン酸を４００：１０：１(ｖ／ｖ)で混合した溶液移動相Ｂ：移動相Ａとメタノールを２：１(ｖ／ｖ)で混合した溶液
グラジエント条件：２０％Ｂ液(２分間)→８０％Ｂ液(２５分間)→８０％Ｂ液(１０分間)、直線濃度勾配
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００６３】
その結果、エノキタケ培養菌糸体から抽出した粗酵素を用いた場合に、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成が確認された。なお、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートに関しては、それらのピークを分取し、ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲを用いて構造を確認した。また、粗酵素液を煮沸した後に酵素反応液に添加した場合や、酵素反応液にＥＧＣＧやＳＡＭを添加しなかった場合には、これらのメチル化体の生成は認められなかった。
以上の結果から、エノキタケ培養菌糸体から抽出した粗酵素がメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することが確認された。
【００６４】
＜各種エノキタケ酵素活性の確認＞
エノキタケの採取地の違い等によるメチルトランスフェラーゼ酵素活性の有無を確認した。エノキタケの菌糸は、農業生物資源ジーンバンクより購入したものを使用し、Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ培地上で２５℃にて培養した。菌糸体の液体培養及び酵素活性測定は、上記＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様にして行った。試験には、ＭＡＦＦ番号４３０２０４、４３０２０５、４３０２０６、４３０２０７、４３０２０９、４３５２１０、４３０２１２、４３０２１４、４３０２２４、４３５０８５、４３０２１１、４３０２１３、４３５１２１、４４０１１０、４４０１１１、及び４４０１１８を用いた。その結果、それぞれの菌糸によって酵素活性の強弱はあるものの、全ての菌糸において、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を確認した。
【００６５】
＜エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの同定＞
上記と同様にしてエノキタケ菌糸体を液体培養し、得られた菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥物約１２ｇを乳鉢で破砕した後、粗酵素溶解液６００ｍｌに懸濁した。この懸濁物を超音波破砕した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）し、回収した上清を再度遠心分離（３０，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４℃）して上清を回収した。この上清に、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して上清を回収した。さらに、この回収した上清に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を、粗酵素溶解液４０ｍｌに溶解した後、ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルは、トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ ＤＥＡＥ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が確認されたフラクションを、活性画分として分取した。なお、メチルトランスフェラーゼ酵素活性の確認は、＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様にして行った。
【００６６】
得られた活性画分を、限外ろ過カラムで脱塩、濃縮した後、上記トリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、活性画分を分取した。得られた活性画分を、限外ろ過カラムにて脱塩、濃縮し、再度同じ陰イオン交換カラムに吸着させ、分取画分を前条件より詳細にして活性画分を分取し、同様に限外ろ過カラムにて脱塩、濃縮を行った。
【００６７】
得られた濃縮画分を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて分画した。分取した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、得られたタンパク質染色像と、各画分のメチルトランスフェラーゼ酵素活性とを比較したところ、酵素活性と相関したバンドが、約２４〜２５ｋＤａの位置に確認された。酵素活性が確認された画分を、さらに、上記トリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ ＢＩＯＡＳＳＩＳＴ Ｑ、東ソー社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、活性画分を分取した。活性画分を、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた結果、約２４〜２５ｋＤａの位置に再度特異的なバンドを確認した。この酵素タンパク質の内部配列を明らかにするために上記陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、バンドをゲルから回収した。
【００６８】
回収したバンドは、常法に従ってゲル内トリプシン消化処理を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてタンパク質の内部配列を解析した。さらに、同じ活性画分を二次元電気泳動で電気泳動し（一次元目：ｐＨ３〜１０の等電点分離、二次元目：４〜２０％グラジエントのポリアクリルアミドゲル）、分子量約２４〜２５ｋＤａ、ｐＨ５付近のスポットをゲルから回収した。図３は、二次元電気泳動像である。図中、丸で囲んだスポットを、目的の酵素タンパク質として回収した。
【００６９】
この回収したスポットに対して常法に従ってゲル内トリプシン消化処理を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、スポットに存在しているタンパク質の内部配列の確認を行った。その結果、内部配列ＲＶＬＥＶＧＴＬＧＧＹＳＴＴＷＬＡＲＡ（配列番号３）及びＴＧＧＩＩＩＶＤＮＶＶＲ（配列番号４）を得た。このアミノ酸配列をもとに、ＮＣＢＩのデータベースによるホモロジー検索を行った結果、既知のＯ−メチルトランスフェラーゼの内部配列と高い相同性を有していた。
【００７０】
＜エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離・同定＞
上記内部配列の配列情報に基づいてディジェネレートプライマーを設計し、エノキタケから回収したｔｏｔａｌ−ＲＮＡから、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を単離・同定した。
具体的には、まず、エノキタケ培養菌糸体約１ｇを、乳鉢を用いて液体窒素下で破砕したものから、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社製）を用いてｔｏｔａｌ−ＲＮＡを回収した。得られたｔｏｔａｌ−ＲＮＡ約４μｇから、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて、５５℃、５０分間反応させることによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、上記内部配列の配列情報に基づいて設計されたディジェネレートプライマー（ＦＶＯＭＴ−Ｆ及びＦＶＯＭＴ−Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離を行った。設計されたディジェネレートプライマーの塩基配列及びＰＣＲ条件を下記に記す。なお、塩基配列中、Ｓはグアニン又はシトシンを、Ｍはアデニン又はシトシンを、Ｙはチミン又はシトシンを、Ｄはアデニン、グアニン、又はチミンを、Ｋはグアニン又はチミンを、Ｖはアデニン、グアニン、又はシトシンを、Ｒはグアニン又はアデニンを、それぞれ示す。
【００７１】
ＦＶＯＭＴ−Ｆ：ＧＡＧＧＴＳＧＧＭＡＣＹＹＴＤＧＧＭＧＧＳＴＡ
ＦＶＯＭＴ−Ｒ：ＧＣＫＳＡＣＶＡＣＲＴＴＲＴＣＭＡＣ
ＰＣＲ条件：９４℃，５ｍｉｎ→（９４℃，１ｍｉｎ→５５℃，１ｍｉｎ→７２℃，１ｍｉｎ）×４０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃，７ｍｉｎ
【００７２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果、約４００ｂｐの増幅バンドが確認された。アガロースゲルから当該バンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を回収し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター(プロメガ社製)へクローニングした後、大腸菌ＪＭ−１０９株（タカラ社製）へ形質転換した。得られた形質転換体を、ＬＢ培地にて３７℃で終夜振とう培養し、得られた培養物からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドのインサートの塩基配列を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００−ＡＶＡＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）により確認した。
【００７３】
確認された遺伝子の部分塩基配列をもとに、特異的プライマー（ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２、ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１、ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２）を設計し、５’側と３’側の全長を取得するためにＲＡＣＥ−ＰＣＲ法を行った。設計した特異的プライマーの塩基配列を下記に示す。
【００７４】
ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１：ＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡ
ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２：ＴＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴ
ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１：ＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡ
ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２：ＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴ
【００７５】
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、まず、単離したｔｏｔａｌ−ＲＮＡ２．５μｇから、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１プライマーを用い、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて、５５℃、５０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。次いで、得られたｃＤＮＡから、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（インビトロジェン社製）を用い、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１プライマー及びＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２プライマーを用いて５’側の単離を行い、塩基配列を確認した。
同様に、３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（インビトロジェン社製）を用いて、得られたｃＤＮＡからＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１プライマー及びＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２プライマーを用いて３’側の単離を行い、塩基配列を確認した。
【００７６】
確認された５’末端及び３’末端の塩基配列に基づき、下記に示すＦＶＯＭＴ−５’ＮｄｅＩプライマー及びＦＶＯＭＴ−３’ＢａｍＨＩプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅バンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換後、インサートの塩基配列を確認した。その結果、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の全遺伝子を単離するにいたった。同定されたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている。
【００７７】
ＦＶＯＭＴ−５’ＮｄｅＩ：ＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＴ
ＦＶＯＭＴ−３’ＢａｍＨＩ：ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣ
【００７８】
［参考例２］
＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の製造＞
参考例１で単離されたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターを大腸菌に導入して、大腸菌内で発現させたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素を回収した。
具体的には、まず、参考例１で作製したエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子含有ｐＧＥＭ−Ｔベクターから、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、アガロース電気泳動により、インサートを回収した。このインサートを、ｐＥＴ２８ａ(＋)ベクター（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトへクローニングすることにより、組換え発現ベクターを作製した。この組換え発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)株（ストラタジーン社製）へ導入することにより、当該組換え発現ベクターを含む形質転換体を得た。
【００７９】
得られた形質転換体をＬＢ培地にて３７℃で終夜振とう培養した後、その一部を再度新しいＬＢ培地へ添加して培養した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．６付近となるように培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに２８℃で振とう培養して、ヒスチジンタグ付酵素タンパク質の発現誘導を行った。発現誘導した大腸菌を遠心分離し、沈殿物を上記トリス緩衝液に懸濁した。この大腸菌懸濁液を超音波破砕し、再度遠心分離した。得られた上清（ライセート）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した結果、ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌を同様に処理して電気泳動した場合と比較して、約２９ｋＤａ付近に、ＩＰＴＧ処理により発現が誘導されたタンパク質のバンドを確認した。
【００８０】
図４は、ＩＰＴＧ処理前の大腸菌のライセート（レーン１）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセート（レーン２）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートからヒスチジンタグを用いて得られた精製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。図中、「Ｍ」は分子量マーカーを流したレーンである。図中の矢印の位置のバンド（約２９ｋＤａ）を画像解析し、タンパク質量を数値化して比較した。画像解析には、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドビシステムズ社製）及びＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）ソフトウェアを使用した。その結果、この約２９ｋＤａのタンパク質量は、ＩＰＴＧ処理前を０％とした場合、ＩＰＴＧ処理後で８．４％、処理後の精製物で２５．１％であり、当該タンパク質が、ＩＰＴＧ処理により発現が誘導されたヒスチジンタグを有するタンパク質であることが確認された。
【００８１】
ｐＥＴ２８ａ(＋)ベクターのＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトへクローニングした場合、約５ｋＤａのベクター由来発現タンパク質（ヒスチジンタグを含む）が付加される。また、配列番号２のアミノ酸配列から算出された本酵素タンパク質の理論分子量は、２４．７ｋＤａである。つまり、図４の矢印で示した約２９ｋＤａのタンパク質は、組換え発現ベクターにより導入したアミノ酸配列から得られる推定分子量と一致し、ヒスチジンタグ付きエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素であることが分かった。
【００８２】
［参考例３］
＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性＞
参考例２で得られたＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の組換え酵素の粗酵素液とし、この粗酵素液のメチルトランスフェラーゼ酵素活性を調べた。
具体的には、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、及び５０％ 粗酵素液となるように、酵素反応液３ｍｌを調製し、この酵素反応液を３７℃、１６時間インキュベートし、反応させた。反応後の酵素反応液を、参考例１の＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して分析した結果、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３,５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成が確認できた。
これらの結果から、参考例２において大腸菌内で発現させた組換え酵素が、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有していることが確認された。
【００８３】
［参考例４］
＜菌糸体抽出粗酵素液を用いたメチル化体の製造＞
参考例１と同様にして、エノキタケ菌糸体培養液の菌糸体から抽出し、得られた抽出物の６０％〜８０％硫酸アンモニウム画分を脱塩処理したものを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液とした。
具体的には、まず、エノキタケ菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を乳鉢にて破砕した後、上記粗酵素溶解液に懸濁して、超音波破砕し、遠心分離して上清を回収した。この上清に、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して上清を回収した。さらに、この回収した上清に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を、粗酵素溶解液に溶解した後、ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて脱塩した。この脱塩サンプルを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液とした。
得られた粗酵素液の各種基質に対するメチルトランスフェラーゼ活性を確認した。酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ 基質、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを３７℃、６時間反応させた。基質には、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキン−３−Ｏ−ガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、カフェ酸、クロロゲン酸、エラグ酸、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、ミリセチン、又はロスマリン酸を、それぞれ用いた。
反応後の酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を、下記の条件でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。標品と比較分析が可能なものについては同定も行った。ＨＰＬＣ条件及びＭＳ条件を以下に示す。
【００８４】
・ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件（ｉ）：８％Ｂ液（２０分間)→２５％Ｂ液（８８分間)
グラジエント条件（ｉｉ）：８％Ｂ液（１０分間)→５０％Ｂ液（３１分間)
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００８５】
・ＭＳ条件
検出器：ＡＰＩ３０００（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン源：ＥＳＩ（ネガティブ）
カーテンガス：１０
ネブライザーガス：１４
ターボガス：６ｌ／ｍｉｎ
イオンスプレー電圧：−４０００Ｖ
イオンスプレー温度：５００度
コーン電圧：−４１Ｖ
【００８６】
ＬＣ−ＭＳ分析の結果を表１に示す。この結果、用いた全ての基質に対して、メチル化体の生成が確認された。これらの結果から、本発明の酵素は、水酸基を有する各種化合物を基質とし、メチル基を修飾することが可能であることが明らかとなった。
また、ＥＣＧのように、化合物中に複数の水酸基を有する化合物の中には、複数種類のメチル化体の生成が確認され、かつ、ジメチル化体も確認された。この結果から、本発明の酵素は、基質の化合物中の複数の水酸基のそれぞれを独立にメチル化可能であることも確認された。
【００８７】
【表１】
【００８８】
［参考例５］
＜反応時間の検討＞
参考例４で用いたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液（以下、天然型酵素）と、参考例２で用いたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素のヒスチジンタグ精製した組換え酵素液（以下、組換え酵素）とを用いて、酵素反応の反応時間を検討した。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３０ｍｌに対して２．５ｍｌ）とし、全量３０ｍｌを３７℃で反応させた。反応開始から５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、２時間、 ４時間、６時間、８時間、２４時間後に、酵素反応液を１ｍｌずつ分取した。これらの酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を、下記のＨＰＬＣ条件で分析した。
【００８９】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件：１０％Ｂ液（１０分間)→１６％Ｂ液（５０分間)
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００９０】
各反応時間後に分取した酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図５に示す。図５（Ａ）が天然型酵素の結果であり、（Ｂ）が組換え酵素の結果である。この結果、天然型酵素では反応開始８時間後で、組換え酵素では２０分後で、ＥＧＣＧメチル化体の生成が最も高い値を示した。
【００９１】
［参考例６］
＜最適ｐＨの検討＞
参考例５において用いた天然型酵素及び組換え酵素の酵素反応における最適ｐＨを調べた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭの各種緩衝液に、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）となるように添加して調製した。用いた緩衝液は、酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．５)、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５〜１０)である。調製した酵素反応溶液の全量３ｍｌを、３７℃で反応させた。反応時間は、天然型酵素で６時間、組換え酵素で１０分間とした。これらの酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を分析した。
各ｐＨの酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図６に示す。この結果、天然型酵素ではｐＨ６．５〜８．５で、組換え酵素ではｐＨ６以上で、ＥＧＣＧメチル化体の生成が確認された。
【００９２】
［参考例７］
＜最適温度の検討＞
参考例５で用いた天然型酵素及び組換え酵素の酵素反応における最適温度を調べた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ） アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを、４、１０、２０、３０、３７、４２、５０、又は６０℃で、それぞれ反応させた。反応時間は、天然型酵素で６時間、組換え酵素で１０分間とした。これらの酵素反応液を、参考例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を分析した。
各温度における酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図７に示す。この結果、天然型酵素では１０〜５０℃において、組換え酵素では行った全ての温度において、ＥＧＣＧメチル化体の合成が確認された。中でも、３０〜４２℃で、両酵素のいずれにおいても良好な酵素活性が確認された。
【００９３】
［参考例８］
＜基質となるテアフラビン標準品の調製＞
島根県出雲産の紅茶（商品名：出雲国産紅茶（リーフ）、西製茶所製）を粉砕し、４０倍量の２％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸含有５０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ水溶液を用いて、２０分間の室温抽出を３回行った。抽出液は遠心分離を行い、抽出液から茶葉を取り除いた。抽出液は、減圧濃縮により有機溶媒を除去した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８（ウォーターズ社製）に供し、１５％、４０％、１００％ＥｔＯＨステップワイズ溶出を行った。テアフラビンが含まれる４０％ＥｔＯＨ画分を凍結乾燥させ、適宜４０％ＥｔＯＨに再溶解し、下記の条件によりテアフラビンの分取を行った。分取したテアフラビンはＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８を用いて脱酸し、凍結乾燥品を作製した。これにより、ＴＦ３Ｇ標準品、ＴＦ３’Ｇ標準品、ＴＦ３，３’Ｇ標準品が得られた。
【００９４】
分取条件；
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２０ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）移動相Ａ：０．０５（ｖ／ｖ）％リン酸水溶液
移動相Ｂ：１２．５（ｖ／ｖ）％酢酸エチルを含むアセトニトリル
グラジエント条件：２４％Ｂ液（５０分間)→５０％Ｂ液（０．１分間）→５０％Ｂ液（１０分間）
流速：１８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【００９５】
［実施例１］
＜メチル化テアフラビンの製造＞
参考例２において製造した組換え酵素を用いて、メチル化テアフラビンの製造を行った。基質としては、参考例８で得られたＴＦ３Ｇ標準品、ＴＦ３’Ｇ標準品、ＴＦ３，３’Ｇ標準品をそれぞれ用いた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６．５)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％（ｗ／ｖ）テアフラビン（基質）、０．５ｍＭ ＳＡＭ、０．０４％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸、及びメチルトランスフェラーゼ（全量１０００ｍｌに対して３３．３ｍｌ）とし、３７℃、６時間で反応させた。その後、酵素反応液１０００ｍｌに対し、２４ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを加え、酵素反応を終了させた。酵素反応液に等量の酢酸エチルを加えて激しく撹拌し、静置後、酢酸エチル層を回収した。残る水層に対し、再度同様の操作を行った。回収した酢酸エチル層は減圧濃縮した後、参考例８と同じ条件でメチル化テアフラビンの分取を行った。分取したメチル化テアフラビンは、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８を用いて脱酸し、凍結乾燥品を作製した。得られたメチル化テアフラビン凍結乾燥品に対して下記の条件でＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、得られた精密分子量から分子式を算出した。また、下記の条件でＮＭＲ（Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ）を測定し、構造同定を行った。
【００９６】
ＴＯＦ−ＭＳ条件；
検出器：ＱＳＴＡＲ ＥＬＩＴＥ（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン源：ＥＳＩ（ネガティブモード）
カーテンガス：３０
イオンソースガス１：５０
イオンソースガス２：５０
イオンスプレー電圧：−４５００Ｖ
イオンスプレー温度：４５０℃
デクラスタリングポテンシャル：−３０Ｖ
フォーカスポテンシャル：−２５０
デクラスタリングポテンシャル：−１５Ｖ
【００９７】
ＮＭＲ条件；
検出器：ＸＷＩＮ−ＮＭＲ ＡＶ６００（ブルカーバイオスピン社）
プローブ温度：３００Ｋ
溶媒：アセトン−ｄ６
【００９８】
ＴＯＦ−ＭＳ、及びＮＭＲ解析の結果を表２〜４に示した。既知化合物である３ＭｅＴＦ３Ｇの他に８種の新規化合物が得られた。各新規化合物をそれぞれ、３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇ（化学式（Ｉ）−１）、３ＭｅＴＦ３’Ｇ（化学式（ＩＩ）−１）、４ＭｅＴＦ３’Ｇ（化学式（ＩＩ）−２）、３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ（化学（ＩＩ）−３）、３，４ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ（式（ＩＩ）−４）、３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ（化学式（ＩＩＩ）−１）、４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ（化学式（ＩＩＩ）−２）、３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇ（化学式（ＩＩＩ）−３）と決定した。
【００９９】
【表２Ａ】
【０１００】
【表２Ｂ】
【０１０１】
【表３Ａ】
【０１０２】
【表３Ｂ】
【０１０３】
【表３Ｃ】
【０１０４】
【表４Ａ】
【０１０５】
【表４Ｂ】
【０１０６】
［実施例２］
＜メチル化テアフラビン含有紅茶ポリフェノールの製造、及び反応効率＞
標準品に代えて参考例８において調製した４０％ＥｔＯＨ画分の凍結乾燥品を基質として、実施例１と同様に酵素反応を行った。酵素反応液は経時的に０．５ｍｌずつ取り分け、実施例１と同様に処理した後、下記の条件で分析することにより、テアフラビンとメチル化テアフラビンの組成を調べた。
【０１０７】
分析条件；
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６ ｘ ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）移動相Ａ：０．０５（ｖ／ｖ）％リン酸水溶液
移動相Ｂ：１２．５（ｖ／ｖ）％酢酸エチルを含むアセトニトリル
グラジエント条件：２４％Ｂ液（５０分間)→５０％Ｂ液（０．１分間）→５０％Ｂ液（１０分間）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ３７５ｎｍ
【０１０８】
メチル化テアフラビン含有紅茶ポリフェノールの製造過程において、テアフラビンとメチル化テアフラビンの組成の推移を経時的に調べた結果を図８に示す。この結果、反応時間の経過とともにメチル化テアフラビンの生成量は増加し、２４時間後で生成量が最大になることが明らかになった。この結果から、メチルトランスフェラーゼを用いた酵素処理によって、紅茶ポリフェノール中のメチル化テアフラビン含量を増やすことが可能であることが明らかとなった。
【０１０９】
［実施例３］
＜メチル化テアフラビンのｐＨ安定性評価＞
実施例１で用いたテアフラビン標準品及び実施例１で得られたメチル化テアフラビンを、４００μＭになるように、４０％（ｖ／ｖ）エタノール含有０．３Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）又は４０％（ｖ／ｖ）エタノール含有０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５)にそれぞれ溶解し、常温におけるｐＨ安定性を調べた。反応開始０、１、２時間後に試料を５０μｌずつ採取し、等量の１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸水溶液を添加して分解反応を停止させ、 ４０％（ｖ／ｖ）になるようにＥｔＯＨを加え、残存する各種テアフラビンを実施例２に記載の方法で分析した。
【０１１０】
反応開始２時間後のメチル化テアフラビン残存率を図９に示す。図９（Ａ）がｐＨ５．０の結果であり、図９（Ｂ）がｐＨ７．５の結果である。この結果、ポリフェノールが安定とされるｐＨ５．０では、全ての化合物がほぼ１００％残存していた。一方、ポリフェノールが不安定とされるｐＨ７．５では、メチル化テアフラビンはテアフラビンよりも良好なｐＨ安定性を有していた。また、評価した全ての化合物において、メチル基の数が増えるほど、ｐＨ安定性が高まることが明らかになった。
【０１１１】
［実施例４］
＜メチル化テアフラビンのヒト肝組織由来Ｓ９フラクションを用いた代謝安定性試験＞
ヒト肝組織由来のＳ９フラクション（シグマ アルドリッチ社製）を用いて、実施例１で用いたテアフラビン標準品及び実施例１で得られたメチル化テアフラビンの代謝安定性を評価した。
反応組成は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホサルフェート、１ｍＭ ウリジン−５’二リン酸−α−Ｄ−グルクロン酸、１ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０６３％ ウシ血清アルブミン、８ｍＭ ＤＴＴ、ヒト肝組織由来Ｓ９フラクション（最終量５０μｇタンパク質）、５μＭ 各種テアフラビン又はメチル化テアフラビンからなる反応液２５０μｌを調製し、３７℃でインキュベートした。反応開始０、１５、３０、６０分後に５０μｌずつ分取し、４５μｌの氷冷したメタノールと、５μｌの１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸水溶液とを加えて攪拌した。その後、１４，０００ｇで３分間遠心分離し、得られた上清から９０μｌを回収し、残存する各種テアフラビンを実施例２に記載の方法で分析した。
【０１１２】
反応開始６０分後の、各種テアフラビン残存率を図１０に示す。その結果、いずれのメチル化テアフラビンも、対応するテアフラビンと比較して残存率が高く、良好な代謝安定性を示した。また、評価した全ての化合物において、メチル基が増えるほどその代謝安定性が向上することが明らかになった。
【０１１３】
［実施例５］
＜メチル化テアフラビンの脂肪蓄積抑制作用評価＞
ＴＦ３Ｇのメチル化体の脂肪蓄積抑制作用を調べた。Ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ（参考例８において、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８に供する前の抽出液）、実施例１で用いたＴＦ３Ｇ（標準品）、実施例１で得られた３ＭｅＴＦ３Ｇ及び３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを被検素材とした。
【０１１４】
まず、ヒト臓器脂肪由来前駆脂肪細胞（Ｌｏｔ．Ｎｏ．８Ｆ３４８２，三光純薬社製）を、前駆脂肪細胞用増殖培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養し、増殖させた。その後、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）に前駆脂肪細胞を１．５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように撒いて２４時間培養した後、培地を前駆脂肪細胞用分化培地に交換して分化を誘導した。分化誘導と同時に、最終濃度がＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔは１０μｇ／ｍｌ、各被検素材は１又は３μＭとなるようにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解して添加した。その後、１日おきに、前駆脂肪細胞用分化培地にＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔは１０μｇ／ｍｌ、各被検素材は１又は３μＭとなるように含有させた培地に交換し、１０日間培養した。培養終了後、細胞内の脂肪蓄積量をＡｄｉｐｏＲｅｄａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）を用いて蛍光強度により評価した（Ｅｘ：４８５ｎｍ， Ｅｍ：５７２ｎｍ）。
【０１１５】
各処理を施した細胞群の脂肪蓄積量の測定結果を図１１に示す。図１１（Ａ）は各被検素材を１μＭとなるように培地中に添加した場合の結果を、図１１（Ｂ）は３μＭとなるように培地中に添加した場合の結果を、それぞれ示す。この結果、ＴＦ３Ｇ、３ＭｅＴＦ３Ｇ、又は３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇを添加した場合には、無添加の場合やＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔを添加した場合よりも数値が低く、脂肪蓄積が抑制されていることが明らかとなった。また、３ＭｅＴＦ３Ｇ及び３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇは、非メチル化体であるＴＦ３Ｇよりも脂肪蓄積抑制作用が強く、中でも、３，５ｄｉＭｅＴＦ３Ｇは、既知化合物である３ＭｅＴＦ３Ｇよりも優れた脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。
これらの結果から、テアフラビンのうち、少なくともＴＦ３Ｇにおいては、メチル化されている水酸基の数が多くなるほど、脂肪蓄積抑制作用が高まることが明らかになった。
【０１１６】
［実施例６］
＜メチル化テアフラビンの抗酸化作用評価＞
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２への過酸化水素水による酸化ストレスに対する、メチル化テアフラビンの抑制効果を評価した。Ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ（参考例８において、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８に供する前の抽出液）、実施例１で用いたＴＦ３’Ｇ及びＴＦ３，３’Ｇ（標準品）、並びに実施例１で得られた３ＭｅＴＦ３’Ｇ、３，５ｄｉＭｅＴＦ３’Ｇ、３ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、４ＭｅＴＦ３，３’Ｇ、及び３，５ｄｉＭｅＴＦ３，３’Ｇを被検素材とした。これらの被検素材は、予めＤＭＳＯに溶解させた。
【０１１７】
ＨｅｐＧ２細胞は、１０％非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有Ｄ−ＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて継代培養した。その後、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）にＨｅｐＧ２細胞を４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように撒き、最終濃度がＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔは０．６、６、６０μｇ／ｍｌ、被検素材は０．２、２、又は２０μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解して添加したＤ−ＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２３時間培養した。培地を除去した後、各ウェルに１５０μｌの１２ｍＭ 過酸化水素水含有Ｄ−ＭＥＭ培地を添加し、細胞を２時間、過酸化水素水に暴露した。その後、上清を除去した各ウェルに、２００μｌの１０％アラマーブルー含有Ｄ−ＭＥＭ培地を添加し、３時間培養後、蛍光強度を測定した（Ｅｘ：５４４ｎｍ， Ｅｍ：５９０ｎｍ）。
【０１１８】
過酸化水素水を添加しなかった場合のＨｅｐＧ２細胞生存率を１００％とし、各濃度の被検素材を添加した場合におけるＨｅｐＧ２細胞生存率を求めた。ＨｅｐＧ２細胞生存率の測定結果を図１２に示す。図１２（Ａ）がＴＦ３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果であり、図１２（Ｂ）がＴＦ３，３’Ｇ及びそのメチル化体を添加した場合の測定結果である。なお、有意差の検定はＴｕｋｅｙ法を用いた。
【０１１９】
過酸化水素水のみを添加した場合やＴｅａ ｅｘｔｒａｃｔを添加した場合と比較した結果、テアフラビンを添加した場合に差は確認できなかったものの、メチル化テアフラビンを添加した場合は細胞生存率がほぼ１００％であり、有意に酸化ストレスが抑制されることが判明した。特に、ＴＦ３’Ｇ及びＴＦ３，３’Ｇにおいては、メチル化テアフラビンのほうが、非メチル化体よりも高い抗酸化作用を有することが確認された。
なお、各被検素材を２又は２０μＭとなるように添加した場合には、非メチル化体と各種メチル化体の間で有意な差は得られなかった。これは、過酸化水素水濃度等の処理条件により、抗酸化作用の効果が必要十分であったためと推察される。
【０１２０】
なお、参考例１〜８及び実施例１〜６において使用した試薬の購入先は、以下の通りである。
Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ：日本ベクトン・ディッキンソン
Ｐｅｐｔｏｎｅ: 日本ベクトン・ディッキンソン
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ：日本ベクトン・ディッキンソン
前駆脂肪細胞用増殖培地：三光純薬
Ｄ−ＭＥＭ培地：和光純薬
分化培地：三光純薬
アラマーブルー:インビトロジェン
ＦＣＳ：ＪＲＨバイオサイエンス
ペニシリン：ＧＩＢＣＯ
ストレプトマイシン：ＧＩＢＣＯ
ＥＧＣＧ：テアビゴ、ＤＳＭニュートリションジャパン
【０１２１】
エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）：フナコシ
カテキン−３−Ｏ−ガレート（ＣＧ）：フナコシ
ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）：フナコシ
カフェ酸：シグマ
クロロゲン酸：フナコシ
エラグ酸：フナコシ
ブテイン：フナコシ
スルフレチン：フナコシ
ルテオリン：フナコシ
ミリセチン：フナコシ
ロスマリン酸：フナコシ
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の新規メチル化テアフラビンは、安定性及び機能性に優れているため、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な商品の製造分野において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有するメチル化テアフラビンであって、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする化合物。
【化１】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【化２】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【化３】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【請求項２】
下記式（Ｉ）−１、（ＩＩ）−１〜４、及び（ＩＩＩ）−１〜３からなる群より選択される１の式で表されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化４】
【化５】
【化６】
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
前記化合物が式（Ｉ）−１で表される化合物であることを特徴とする請求項４記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項７】
前記化合物が、式（ＩＩ）−１、（ＩＩ）−３、（ＩＩＩ）−１、（ＩＩＩ）−２、及び（ＩＩＩ）−３で表される化合物から選択される１種以上であることを特徴とする請求項６記載の抗酸化剤。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする飲食品。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする化粧品。
【請求項１１】
下記式（Ｉ）−０で表される化合物、下記式（ＩＩ）−０で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩ）−０で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を基質として、メチルトランスフェラーゼ酵素を反応させることにより、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物、及び下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を合成することを特徴とする、メチル化テアフラビンの製造方法。
【化７】
【化８】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【化９】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【化１０】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【請求項１２】
前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の酵素であることを特徴とする請求項１１記載のメチル化テアフラビンの製造方法。
【請求項１】
１又は２以上の水酸基がメチル化されたガロイル基を有するメチル化テアフラビンであって、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１の式で表されることを特徴とする化合物。
【化１】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【化２】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【化３】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【請求項２】
下記式（Ｉ）−１、（ＩＩ）−１〜４、及び（ＩＩＩ）−１〜３からなる群より選択される１の式で表されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化４】
【化５】
【化６】
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
前記化合物が式（Ｉ）−１で表される化合物であることを特徴とする請求項４記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項７】
前記化合物が、式（ＩＩ）−１、（ＩＩ）−３、（ＩＩＩ）−１、（ＩＩＩ）−２、及び（ＩＩＩ）−３で表される化合物から選択される１種以上であることを特徴とする請求項６記載の抗酸化剤。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする飲食品。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の化合物を含むことを特徴とする化粧品。
【請求項１１】
下記式（Ｉ）−０で表される化合物、下記式（ＩＩ）−０で表される化合物、及び下記式（ＩＩＩ）−０で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を基質として、メチルトランスフェラーゼ酵素を反応させることにより、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物、及び下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群より選択される１種以上の化合物を合成することを特徴とする、メチル化テアフラビンの製造方法。
【化７】
【化８】
［式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも２以上がメチル基である。］
【化９】
［式（ＩＩ）中、Ｒ４〜Ｒ６は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６の少なくとも１以上がメチル基である。］
【化１０】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ７〜Ｒ１２は水素原子又はメチル基を表し、かつ、Ｒ７〜Ｒ１２の少なくとも１以上がメチル基である。但し、Ｒ７のみがメチル基である場合を除く。］
【請求項１２】
前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の酵素であることを特徴とする請求項１１記載のメチル化テアフラビンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−２５６１６５（Ｐ２０１１−２５６１６５Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０８４４９（Ｐ２０１１−１０８４４９）
【出願日】平成２３年５月１３日（２０１１．５．１３）
【出願人】（０００００００５５）アサヒグループホールディングス株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１３日（２０１１．５．１３）
【出願人】（０００００００５５）アサヒグループホールディングス株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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